張曉麗 張曉紅 葉 雷 朱 偉 莊乾英 沈方臻

1.山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，山東臨沂 276000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤三科，山東青島 266000

肺癌是最常見(jiàn)的腫瘤類型之一，嚴(yán)重威脅人類的生存和健康，屬致死率較高的惡性腫瘤之一。小細(xì)胞肺癌（small celllung cancer，SCLC）作為肺癌的一種特殊類型，屬于惡性程度極高的神經(jīng)內(nèi)分泌癌，占肺癌發(fā)生率的20%～25%[1-3]，并且近年來(lái)發(fā)病率有升高的趨勢(shì)，發(fā)生的主要原因是吸煙，也與其他環(huán)境因素、職業(yè)致癌物有關(guān)，其5年生存率極低；中老年發(fā)病率高，男性較女性多，主要的生物學(xué)行為有轉(zhuǎn)移早、增長(zhǎng)快、對(duì)初始化療敏感、易耐藥等。SCLC惡性程度高，復(fù)發(fā)率及死亡率遠(yuǎn)高于非小細(xì)胞肺癌（non-smalll cell lung cancer，NSCLC），目前的主要治療手段局限于手術(shù)、放化療，并且可手術(shù)的患者極少，因大部分患者發(fā)病時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此對(duì)SCLC基因?qū)W方面的深入研究，有望使分子靶向治療成為一種有效的治療新方案。

SASH1（SAM-and SH3-domaincontaining1）基因是2003年由Zeller等[3]首次發(fā)現(xiàn)，并提出其可能作為一種抑癌基因，屬于進(jìn)化上保守的SLY基因家族的一員。研究發(fā)現(xiàn)SASH1基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物在體內(nèi)多種正常組織內(nèi)廣泛存在，而在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如乳腺癌[3]、甲狀腺癌[4]，并與腫瘤的增殖、侵襲和遷移相關(guān)[5-8]。本研究就SASH1基因在SCLC的表達(dá)及與相關(guān)病理特征的關(guān)系展開(kāi)探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年2月至2018年2月臨沂市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除后經(jīng)組織病理學(xué)診斷為SCLC石蠟標(biāo)本，癌組織及癌旁組織各30例，其中男24例，女6例，平均年齡（59.20±2.12）歲。納入標(biāo)椎：①病理診斷為小細(xì)胞肺癌；②未行抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤復(fù)發(fā)患者；②合并其他類型腫瘤或其他嚴(yán)重疾病。所有患者術(shù)前均無(wú)相關(guān)放化療史，臨床病歷資料完善。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 觀察指標(biāo)

①SASH1蛋白在SCLC癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況；②SASH1基因表達(dá)與SCLC臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）的關(guān)系。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

所有手術(shù)標(biāo)本應(yīng)用福爾馬林固定，固定完成后標(biāo)本行4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟及水化后，應(yīng)用檸檬酸鹽溶液抗原修復(fù)處理，之后自然冷卻至室溫，再經(jīng)3% H2O2阻斷其內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。用10%山羊血清封閉，以抗SASH1多克隆抗體（abcam，ab111901）孵育，4℃過(guò)夜。次日復(fù)溫至室溫后使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（中杉金橋，ZB2301）孵育，DAB顯色。用蘇木素染核1 min，并經(jīng)過(guò)脫水、透明、封片、晾干過(guò)程。使用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.4 染色結(jié)果判讀

應(yīng)用雙盲方法進(jìn)行評(píng)估，由兩位病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生在100倍鏡下分別進(jìn)行閱片。染色強(qiáng)度記為：0分：無(wú)染色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比計(jì)分：0分：陰性；1分：≤10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。兩項(xiàng)積分乘積＜3分判為陰性，≥3分判為陽(yáng)性。之后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，分析SASH1蛋白在SCLC中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SASH1蛋白在SCLC癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)

SASH1蛋白主要在SCLC癌組織及癌旁組織的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，部分細(xì)胞核中亦有表達(dá)（圖1）。30例癌組織中，有13例表達(dá)SASH1蛋白，表達(dá)陽(yáng)性率為43.33%，30例癌旁組織中，有26例表達(dá)SASH1蛋白，表達(dá)陽(yáng)性率為86.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.381，P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 SASH1蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖1 SASH1蛋白在SCLC癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)

2.2 SASH1基因表達(dá)與SCLC臨床病理特征的關(guān)系

SASH1在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率（70.00%）高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（30.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SASH1在不同性別組、年齡組、腫瘤長(zhǎng)徑組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 SASH1基因表達(dá)與SCLC臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

SCLC被認(rèn)為是一種全身性疾病，以化療為主聯(lián)合放療和（或）手術(shù)等綜合性治療。過(guò)去幾十年治療過(guò)程中，SCLC的一線化療方案仍以依托泊苷聯(lián)合鉑類為主的方案，盡管其暫時(shí)對(duì)放化療敏感，但很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來(lái)NSCLC靶向治療突飛猛進(jìn)，而SCLC近40年來(lái)的治療缺乏突破性進(jìn)展。因此，探索SCLC的基因?qū)W研究，能為SCLC的治療帶來(lái)一線希望。

SASH1基因是2003年Zeller等[3]在研究乳腺癌過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一種新基因，并提出該基因可能是乳腺癌一種新的抑癌基因。Zeller通過(guò)分析該基因，將其命名為SAM-andSH3-domaincontaining1。SASH1被認(rèn)為影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這種推測(cè)在U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞[5]、A549人肺腺癌細(xì)胞[6]、A-375黑色素瘤細(xì)胞[7]、MG-63骨肉瘤細(xì)胞[6]中得到了證實(shí)。SASH1可通過(guò)多種途徑應(yīng)用于腫瘤的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有的研究表明腫瘤抑癌基因SASH1的缺失或下調(diào)表達(dá)足以引起上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。E-鈣黏蛋白的表達(dá)減少或缺失在腫瘤進(jìn)展為侵襲性癌的過(guò)程中扮演著重要的角色，并且是EMT一個(gè)公認(rèn)的標(biāo)志物[9]。Dongre等[10]發(fā)現(xiàn)EMT的激活會(huì)引起細(xì)胞極性的喪失、細(xì)胞間連接的破壞、基底膜降解以及細(xì)胞外基質(zhì)的重組。Franke等[11]在研究結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，SASH1的缺失可誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且此過(guò)程通過(guò)CRKL介導(dǎo)的SRC信號(hào)途徑。Zong等[12]發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1-SASH1可有效增加TSGH細(xì)胞中SASH1蛋白的表達(dá)，TGF-B1誘導(dǎo)E-鈣黏蛋白下調(diào)及N-鈣黏蛋白上調(diào)的情況在SASH1轉(zhuǎn)染的TSGH細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)。EMT的分化過(guò)程將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為侵襲性強(qiáng)的間充質(zhì)樣細(xì)胞，被認(rèn)為是形成轉(zhuǎn)移瘤的前提[13-15]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的EMT導(dǎo)致SASH1在癌細(xì)胞群中表達(dá)顯著降低。而SASH1過(guò)表達(dá)減少了細(xì)胞遷移，增加了細(xì)胞基質(zhì)黏附[16]。因此，多項(xiàng)證據(jù)表明，兩者之間存在相互關(guān)系，并將SASH1作為EMT的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。缺氧誘導(dǎo)的EMT在胰腺癌中被證明可獨(dú)立下調(diào)SASH1的表達(dá)[17]。因此在EMT過(guò)程中下調(diào)SASH1的表達(dá)可促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)表型的轉(zhuǎn)化。SASH1蛋白可調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，SASH1蛋白通過(guò)FAK及AKT/PI3K[4，18]調(diào)節(jié)信號(hào)，并且過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)凋亡[6，8]。有研究結(jié)果顯示SASH1蛋白與ERK信號(hào)通路有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，ERK信號(hào)通路中的重要成員MAP2K2和MAP4K4，與SASH1蛋白存在蛋白-蛋白相互作用，并且SASH1蛋白的表達(dá)抑制可以增強(qiáng)ERK1/2的磷酸化水平，意味著SASH1蛋白可能通過(guò)與MAP2K2和MAP4K4分子的相互作用參與了ERK信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等細(xì)胞過(guò)程[19]。鄺中淑等[20]證實(shí)了乳腺癌中p53與SASH1的表達(dá)存在一定的相關(guān)性，突變型及野生型SASH1基因上調(diào)內(nèi)源性及外源性p53表達(dá)，該研究中發(fā)現(xiàn)突變型p53可抑制SASH1基因的表達(dá)，導(dǎo)致SASH1蛋白表達(dá)下調(diào)，從而在乳腺癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。根據(jù)以往的研究，SASH1基因的表達(dá)下調(diào)可能與SASH1啟動(dòng)子的高甲基化有關(guān)[3]。在對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，SASH1蛋白過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株中，MMP-2/9減低，而Caspases-3升高，提示SASH1蛋白可能干預(yù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程[5]。

本研究結(jié)果顯示，SASH1蛋白在SCLC癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于癌旁組織中的，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SCLC患者的SASH1陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SCLC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SASH1在不同性別組、年齡組、腫瘤大小組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過(guò)以上結(jié)果，SASH1基因在SCLC癌組織及癌旁組織的表達(dá)的差異性，與此基因在其他癌種中的研究結(jié)果相符，提示SASH1基因可能是SCLC的抑癌基因。因SCLC能早期發(fā)現(xiàn)并行手術(shù)治療的病例較少，導(dǎo)致本研究收集的樣本量相對(duì)較少。筆者將繼續(xù)致力于SASH1基因與SCLC的相關(guān)性研究，以期尋找SCLC新的治療方法。