韓素霞 吳晶晶 李景峰

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 201299)

冠脈內(nèi)皮細胞于特定病理狀態(tài)下能往間充質(zhì)細胞不斷轉(zhuǎn)化，表型和功能也會隨之出現(xiàn)變化，即內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(End-MT)。據(jù)有關研究顯示[1]，End-MT的異常活化引發(fā)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多從而促使心肌纖維化出現(xiàn)，抑制End-MT可對心肌的纖維化進展產(chǎn)生一定抑制作用。c-SKI屬于Sloan-Kettering逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)所分離得到，其中c-SKI原癌基因編碼核蛋白，能對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smad通路起到負性調(diào)控作用，有著生物多效性[2]。以往研究發(fā)現(xiàn)c-SKI能對成纖維細胞表型產(chǎn)生調(diào)控作用，進而具備抗纖維化特性，但有關c-SKI于End-MT內(nèi)作用研究較少[3]。轉(zhuǎn)化因子-化(TGF-β)屬于EndMT中關鍵性的啟動因子，據(jù)有關研究顯示，微小DNA(miRNA)對于EndMT過程中有著調(diào)控作用[4]。本文就TGF-β、miRNA以及c-Ski于人冠脈內(nèi)皮細胞調(diào)控內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制開展分析，以期為心肌纖維化預防及治療提供出新策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 人冠脈內(nèi)皮細胞由美國ScienCell公司提供；TGF-β1為R&D System提供；帶有綠色熒光蛋白c-SKI慢病毒載體(湖南贏潤生物技術有限公司)；Smad2以及Smad3均由Cell Signaling Technology提供；抗E-鈣黏蛋白(E-ead)、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3與GAPDh抗體均由Thermo Fisher提供；抗c-SKI、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)與波形蛋白(vimentin)抗體由Abeam提供；TRIzoI RNA試劑盒為TaKaRa提供。

1.2細胞培養(yǎng)和感染 人冠脈內(nèi)皮細胞在培養(yǎng)基內(nèi)開展培養(yǎng)同時加10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素，于5%CO2、95%O2潮濕培養(yǎng)箱內(nèi)進行37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)到匯合狀態(tài)，后選取0.25%的胰酶與0.02%的EDTA混合液充分消化和傳代，到2-5代可用于實驗。等到細胞融合至70%左右能換成無血清培養(yǎng)基進行6 h饑餓，后開展細胞感染。于6孔板內(nèi)依據(jù)每孔接種1×106個細胞開展接種，病毒滴度是1×108TU/L開展感染，對細胞狀態(tài)進行觀察，等到感染48 h之后開展轉(zhuǎn)染效率檢測同時開展后續(xù)實驗。

1.3實驗分組 采取0 ng/mL、1 ng/mL、2.5 g/mL及5 ng/mL幾種濃度梯度TGF-β1誘導冠脈內(nèi)皮細胞，經(jīng)免疫印跡法對c-SKI于皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化細胞中的表達情況和End-MT有關分子標志物開展檢測，具體方法如下：于不同處理后，獲取冠脈內(nèi)皮細胞同時采取裂解緩沖液勻漿，采取BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒對蛋白質(zhì)濃度開展分離，經(jīng)8-10%的SDSPAGE對蛋白質(zhì)開展分析，轉(zhuǎn)PVDF膜。采取抗e-SKI、E-cad、α-SMA、vimentin與GAPDH特異性的I抗(比例1∶1 000)、抗Smad2與Smad3特異I抗(比例1∶1 000)和抗p-Smad2與p-Smad3特異I抗(比例1∶1 000)開展孵育，采取5%的脫脂奶粉將其封閉，后將膜和辣根過氧化物酶所標記II抗(比例1∶5 000)g共同溫育2 h，經(jīng)TBST開展3次洗膜，采取ECL化學發(fā)光底物進行顯色之后成像，于ImageJ軟件上對測試結(jié)果開展分析。篩選出可靶向結(jié)合c-SKI3′-UTR的microRNA，后采取熒光素酶報告基因系統(tǒng)對其結(jié)合及調(diào)控關系開展驗證，采取PCR擴增含miR-200a結(jié)合位點在內(nèi)HMGB1基因3′UTR序列，將其插入至pMIR REPORT lucaferase載體的多克隆位點內(nèi)，命名重組載體成wt-HMGB1。制定引物對wt-HMGB1的重組質(zhì)粒種子區(qū)開展突變，同時命名成mut-HMGB1。所有構(gòu)建獲取表達質(zhì)粒均是經(jīng)過酶切以及測序鑒定。把pMIR-REPORT LUCIFERASE空載體與重組質(zhì)粒野生型或者突變型HMGB1有關3′-UTR熒光素酶表達載體依次和miR-200a mimics、mimics NC的共轉(zhuǎn)染工具細胞HEK293，同時建立空白對照組，進行24 h轉(zhuǎn)染后棄去培養(yǎng)液，單孔加入100μL 1×Passive Lysis Buffer×裂解緩沖液PLB，PLB加入至4倍體積蒸餾水內(nèi)混勻，在4°C下放置10 min，再離心1 min，選擇上清液，檢測出β-半乳糖苷酶相對活性、熒光素酶活性表達強度。熒光信號和相應β-半乳糖苷酶的吸光度值比是標定后熒光素酶的相對活性。

2 結(jié) 果

2.1CSKI于TGF-β1誘導冠脈內(nèi)皮細胞中表達情況 不同濃度TGF-β1組作用48 h之后，c-SKI表達呈現(xiàn)劑量依賴性降低，和空白對照組比較，5 μg/L組c-SKI表達降低最明顯(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度TGF-β1組作用48 h后的c-SKI表達情況

2.2過表達C-SKI對于內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關分子標志物和TGF-β/Smad信號通路影響和對照病毒感染+TGF-β1組比較，C-SKI基因感染+TGF-β1組冠脈內(nèi)皮細胞內(nèi)vimentin與a-SMA蛋白表達明顯下降，E-ead蛋白表達升高(P<0.05)。C-SKI過表達后，各組的細胞Smad2與Smad3蛋白水平無顯著改變；和對照病毒感染+TGF-β1組比較，C-SKI基因感染+TGF-β1組p-Smad2與p-Smad3蛋白水平明顯下降(P<0.05)。

2.3不同濃度TGF-β1與miR-200a對內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程影響 MiR-200a mimics轉(zhuǎn)染后和對照組比較miR-200a表達明顯上升(P<0.05)。1 ng/mL、2.5 g/mL及5 ng/mL濃度TGF-β1組與0 ng/mL濃度TGF-β1組對比，CD31與FSP1蛋白表達顯著上升；于1 ng/mL、2.5 g/mL濃度TGF-β1組和0 ng/mL濃度TGF-β1組中，miR-200組和對照組比較，其CD31及VEcadherin蛋白表達顯著上升(P<0.05)，a-SMA與FSP1蛋白表達顯著下降(P<0.05)。

3 討 論

End-MT屬于一類受高度調(diào)節(jié)病理過程，主要涉及到內(nèi)皮功能障礙、不同信號通路和炎癥等，當前被明確規(guī)定是纖維化進程調(diào)節(jié)中的關鍵性機制[5]。End-MT參加心肌的纖維化進程。于疾病進程當中，End-MT過程為動態(tài)的，且間質(zhì)細胞能往內(nèi)皮方向進行逆向轉(zhuǎn)化。

TGF-β1屬于一類心肌損傷炎癥階段和纖維化期的經(jīng)典介質(zhì)，于重塑過程中能對細胞周期進行控制[6-7]。TGF-β1能經(jīng)Smad依賴途徑，抑制巨噬細胞炎癥介質(zhì)和炎癥基因生成，提升肌成纖維細胞的分化和基質(zhì)沉積。在End-MT調(diào)節(jié)中，TGF-β1/Smad信號通路有著類似的作用，TGFβ1依賴Smad2/3信號途徑激活，促進細胞從血管內(nèi)皮區(qū)域向纖維化組織區(qū)域分布，并表達間充質(zhì)細胞標記物，若抑制TGFβ信號，則能負性調(diào)控End-MT的發(fā)生，減輕心肌纖維化[8-9]。c-SKI是禽類白血病轉(zhuǎn)化病毒 v-SKI的細胞內(nèi)同源物，于機體中被稱為SKI。c-SKI可當作靶基因參加心肌的成纖維細胞與ECM生成調(diào)節(jié)，于心肌細胞H9C2內(nèi)沉默c-SKI表達能促使TGF-β1所誘導End-MT[10-11]。本次研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能對C-SKI表達產(chǎn)生抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴性，過表達c-SKI能抑制冠脈內(nèi)皮細胞p-Smad2與p-Smad3表達，說明c-SKI對End-MT的抑制機制有可能和抑制TGF-β1/Smad這一信號通路活性相關。miRNA是非編碼RNA的一種，可抑制轉(zhuǎn)錄或者拮抗相應的mRNA調(diào)控特定蛋白的表達，其能經(jīng)靶向驅(qū)動分子過程中的不同底物參與調(diào)節(jié)涉及纖維化的重要分子信號通路，如TGF-β通路和整合素通路[12-13]。有研究表明[14-15]，miRNA可以直接調(diào)節(jié)線粒體水平的運動能力，組織特異性miRNA釋放到體內(nèi)，液體可以作為旁分泌信號分子并反映生理和/或病理條件，循環(huán)miRNA作為心血管疾病診斷和預后的標記物。因此，miRNA可作為非侵入性早期診斷的生物標志物，然而特定的miRNA目標基因的驗證和相關的信號通路的識別尚不全面，有待于進一步研究。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-200能靶向HMGB1對乳腺癌的細胞轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制。本次研究得出，TGF-β1能使CD31和VEcadherin表達降低以促進a-SMA和FSPI表達，TGF-質(zhì)細加快內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。而miR-200a和TGF-β1作用相反，其能抑制內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，分析機制可能是經(jīng)靶向抑制HMGB1以抑制TGF-β1誘導End-MT過程，這為miR-200a當作心肌纖維化治療新方向提供出了一定理論方面的依據(jù)。

綜上所述，于End-MT時C-SKI表達下調(diào)，C-SKI過表達可抑制冠脈內(nèi)皮End-MT，機制可能和對TGF-β1/Smad信號通路的活性調(diào)控相關。miR-200a能抑制End-MT過程，作用機制可能和靶向抑制HMGB1對TGF-β1產(chǎn)生調(diào)控作用有關。