魯海坤，于 營，劉亞苓，隋 昕，雷慧霞，郭 靖

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130000）

蒙古黃芪(Astragalus mongholicusBunge)，是豆科黃芪屬多年生藥用植物，主要分布于山西、河北、內(nèi)蒙古、黑龍江和吉林等地，其干燥根名為黃芪，是我國傳統(tǒng)大宗藥材。黃芪性微溫味甘，歸肺脾經(jīng)，為補(bǔ)氣諸藥之最，藥用歷史悠久且價(jià)值高，近年來黃芪的開發(fā)利用越來越受到國內(nèi)外重視，野生資源已不能滿足市場(chǎng)需求，商品黃芪主要來源于人工栽培。蒙古黃芪種子不僅是繁殖材料，也是種質(zhì)資源遺傳載體，因此為保證黃芪產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，研究其種子活力喪失機(jī)理和適宜貯藏條件尤為重要。

由于在自然條件下難以在短時(shí)間內(nèi)獲得不同活力批次的種子，故提出人工加速老化方法［1］。許多報(bào)道表明，人工加速老化可以模擬自然老化，兩者老化機(jī)理沒有差異［2-3］。人工加速老化試驗(yàn)是采用高溫高濕條件使種子快速喪失活力的方法，控制劣變與人工加速老化原理相似，但是可以控制種子含水量。而含水量可以影響種子內(nèi)部氧化反應(yīng)，從而進(jìn)一步影響種子活力水平，是影響種子貯藏壽命的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)通過控制劣變的方法研究不同含水量蒙古黃芪種子劣變過程中種子發(fā)芽指標(biāo)、生理生化指標(biāo)的變化，旨在分析引起種子活力下降與其生理生化特性的變化關(guān)系，揭示蒙古黃芪種子劣變的機(jī)理，為蒙古黃芪種子常規(guī)貯藏及低溫種質(zhì)庫貯藏供理論、技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的種子購于河北安國，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)所郭靖研究員鑒定為蒙古黃芪(Artragalus mongholicus)種子。種子初始含水量為9.8%，發(fā)芽率為89%。將種子置于硅膠干燥器中進(jìn)行干燥處理，得到含水量為3.7%、6.6%和9.8%的種子，將3種含水量的種子用鋁箔袋密封包裝備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 控制劣變處理 將不同含水量種子置于(53±0.5) ℃恒 溫 水 浴 鍋 中 人 工 劣 變0、3、6、12 d得到不同活力水平的種子，試驗(yàn)前種子貯藏于4 ℃冰箱。

1.2.2 種子回濕處理 采用逐級(jí)回濕的方法，20 ℃條件下，將裝有含水量3.7%種子的尼龍網(wǎng)袋依次放入盛有飽和氯化鈣溶液(35% RH)、飽和氯化銨溶液(70% RH)和水(100% RH)的干燥器中，各自平衡24 h ，后進(jìn)行發(fā)芽測(cè)定。

1.2.3 種子發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定 種子發(fā)芽率測(cè)定參照ISTA的方法進(jìn)行［4］，挑選籽粒飽滿、大小均一的黃芪種子，采用濾紙發(fā)芽床，將兩層濾紙置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿100粒，3次重復(fù)。置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，溫度和光照控制為15/25 ℃ 〔高溫8 h，低溫16 h，高溫時(shí)光照（36 mmol/m2·s），低溫時(shí)黑暗〕。逐日檢查發(fā)芽種子數(shù)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率(%)=(終發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為t日發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)天數(shù)

1.2.4 生理生化指標(biāo)測(cè)定 活性氧含量測(cè)定使用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD） 、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定參考宋松泉［5］的方法進(jìn)行，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量測(cè)定參考高俊鳳［6］的方法進(jìn)行。1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖，使用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 控制劣變對(duì)蒙古黃芪種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

由圖1可知，劣變處理前不同含水量種子之間發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無顯著差異。在劣變3～6 d時(shí)，含水量3.7%和6.6%的種子發(fā)芽率無顯著差異且都顯著高于9.8%的種子（P＜0.05），劣變12 d時(shí)不同含水量種子之間發(fā)芽率差異顯著（P＜0.05）。而在劣變3～12 d 期間，不同含水量種子之間發(fā)芽指數(shù)均有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 控制劣變對(duì)不同含水量蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響Fig. 1 Effect of CDT on the germination rate of A.mongholicus seeds with different water content

隨著劣變時(shí)間延長，不同含水量的蒙古黃芪種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且隨種子含水量升高，發(fā)芽指標(biāo)下降幅度增大。種子發(fā)芽指標(biāo)大幅下降說明劣變明顯影響了種子活力，使種子萌發(fā)能力減弱。而含水量3.7%的種子相對(duì)于含水量6.6%和9.8%的種子，其發(fā)芽速度更快更整齊，說明低含水量種子抵御高溫刺激的能力更強(qiáng)。

2.2 控制劣變對(duì)蒙古黃芪種子活性氧積累的影響

超氧陰離子是大部分ROS的前體，積累過多會(huì)對(duì)細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體代謝異常。由圖2A可以看出，隨著劣變時(shí)間延長，超氧陰離子產(chǎn)生速率總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。劣變0和6 d時(shí)，各含水量種子的超氧陰離子產(chǎn)生速率無顯著差異；劣變3 d時(shí)，含水量3.7%和6.6%種子的超氧陰離子產(chǎn)生速率無顯著差異，且均顯著低于含水量9.8%的種子；劣變12 d時(shí)，含水量6.6%和9.8%的種子的超氧陰離子產(chǎn)生速率無顯著差異，且顯著高于含水量3.7%的種子（P＜0.05）。

圖2 控制劣變對(duì)不同含水量蒙古黃芪種子O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響Fig. 2 Effects of CDT on O2- production rate and H2O2 content of A.mongholicus seeds with different water content

H2O2是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，可以使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體，同時(shí)它也是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的調(diào)節(jié)因子。如圖2B所示，蒙古黃芪種子內(nèi)H2O2含量隨劣變時(shí)間進(jìn)行整體呈上升趨勢(shì)。劣變0 d時(shí)，各含水量種子H2O2含量無顯著差異；劣變3 d時(shí)，含水量9.8%的種子H2O2含量顯著高于含水量3.7%（P＜0.05），含水量6.6%的種子居中；劣變6～12 d時(shí)，不同含水量的種子H2O2含量均有顯著差異（P＜0.05），且隨含水量升高而升高。

氧氣在生物體內(nèi)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生一些活潑的物質(zhì)如超氧陰離子（O2-）、氫氧根離子（OH-）羥自由基(·OH)、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧(1O2·)等，它們統(tǒng)稱為活性氧，且氧化能力較強(qiáng)。植物細(xì)胞內(nèi)的多種細(xì)胞器或者部位都可以產(chǎn)生活性氧，且在正常生命活動(dòng)中活性氧產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而當(dāng)植物受生物或非生物脅迫時(shí)，其體內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生和清除機(jī)制會(huì)失去平衡，氧脅迫改變植物代謝、生長及發(fā)育的進(jìn)程，使細(xì)胞功能發(fā)生紊亂甚至喪失，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對(duì)于種子而言，積累過多的活性氧產(chǎn)生膜脂過氧化，降低膜完整性，表現(xiàn)為種子活力降低。含水量3.7%的種子可能由于種子內(nèi)自由水含量低，代謝微弱，產(chǎn)生的活性氧相對(duì)于6.6%和9.8%的種子較少，這有助于延緩種子衰老。

2.3 控制劣變對(duì)蒙古黃芪種子抗氧化酶活性的影響

如圖3A所示，SOD活性在劣變0～3 d迅速上升，之后的劣變過程中保持穩(wěn)定。在劣變0 d，不同含水量蒙古黃芪種子SOD活性均有顯著差異（P＜0.05），且SOD活性隨含水量升高而升高；劣變3和6 d時(shí)，含水量6.6%的種子SOD活性最高，含水量3.7%的種子SOD活性居中，含水量9.8%的種子SOD活性最低；劣變12 d時(shí)，各含水量種子SOD活性無顯著差異。如圖3B所示，APX活性變化與含水量有關(guān)，含水量3.7%和6.6%的種子APX活性先升高再降低，含水量9.8%的種子APX活性隨劣變時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。劣變0 d，含水量6.6%和9.8%的種子APX活性無差異且顯著低于含水量6.6%的種子；劣變3 d時(shí)APX活性隨含水量升高降低；劣變6 d時(shí)，含水量3.7%和6.6%無顯著差異，且顯著高于含水量9.8%的種子（P＜0.05）；劣變12 d，APX活性隨含水量升高而顯著降低（P＜0.05）。如圖3C所示，DHAR活性變化與含水量有關(guān)，含水量3.7%和6.6%的蒙古黃芪種子DHAR活性先升高再降低，含水量9.8%的種子DHAR活性隨劣變時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。劣變0 d時(shí)，各含水量的種子之間DHAR活性無顯著差異；劣變3 d時(shí)，含水量3.7%和6.6%的種子DHAR活性無顯著差異（P＞0.05），且均顯著高于含水量9.8%的種子（P＜0.05）；劣變6和12 d時(shí)，不同含水量的種子DHAR活性有顯著差異（P＜0.05），隨含水量升高而降低。如圖3D所示，MDHAR活性隨劣變時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且在劣變過程中酶活性隨種子含水量升高而降低。在劣變0 d時(shí)，各含水量種子之間酶活性無顯著差異；劣變3 d時(shí)，含水量6.6%和9.8%的種子酶活性無顯著差異，且顯著低于含水量3.7%的種子（P＜0.05）；劣變6 d時(shí)，含水量3.7%的種子酶活性顯著高于9.8%的種子（P＜0.05），含水量6.6%的種子酶活性居中；劣變12 d，不同含水量的種子酶活性有顯著差異（P＜0.05），且酶活性隨含水量升高而降低。

圖3 控制劣變對(duì)不同含水量蒙古黃芪種子抗氧化酶活性的影響Fig. 3 The effect of CDT on the antioxidant enzyme activity of A.mongholicus seeds with different water content

如圖3E所示，GR活性隨劣變時(shí)間延長總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在劣變0和3 d時(shí)，含水量6.6%和9.8%的種子GR活性無顯著差異，且顯著高于含水量3.7%的種子（P＜0.05）；在劣變6 d時(shí)，含水量3.7%和6.6%的種子酶活性無顯著差異，且顯著高于含水量9.8%的種子（P＜0.05）；劣變12 d時(shí)，不同含水量的種子酶活性均有顯著差異，且酶活性隨含水量升高而降低。

SOD活性隨劣變進(jìn)行其活力不斷升高，表明在高溫環(huán)境刺激下，種子內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的應(yīng)激反應(yīng)來清除機(jī)體產(chǎn)生的活性氧。APX、DHAR、MDHAR、GR等4種酶有先升高后降低的趨勢(shì)，表明在劣變初期，這些酶在種子內(nèi)發(fā)揮清除活性氧的作用，而當(dāng)種子劣變程度加劇的時(shí)候，酶活性受到抑制，清除活性氧能力降低，使得活性氧進(jìn)一步積累。種子抗氧化酶活性的變化與含水量密切相關(guān)，含水量3.7%的種子在劣變過程中，其5種抗氧化酶活性整體高于含水量6.6和9.8%的種子，表明其抗逆能力更強(qiáng)，活力更高，

2.4 控制劣變對(duì)蒙古黃芪種子MDA含量的影響

如圖4所示，隨著劣變時(shí)間的進(jìn)行，不同含水量的蒙古黃芪種子MDA含量都呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。劣變0 d時(shí)，含水量6.6%的種子MDA含量顯著高于含水量9.8%的種子（P＜0.05），含水量3.7%的種子含量居中；劣變3、6和12 d時(shí)，含水量6.6%和9.8%的種子MDA含量無顯著差異，且均顯著高于含水量3.7%的種子。

圖4 控制劣變對(duì)不同含水量蒙古黃芪種子MDA含量的影響Fig. 4 The effect of CDT on the MDA content of A.mongholicus seeds with different water content

種子在劣變過程中不斷產(chǎn)生活性氧，攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應(yīng)。隨種子劣變程度加深，活性氧平衡遭到破壞，過剩的氧自由基加劇膜脂過氧化作用產(chǎn)生有毒害的醛類物質(zhì)如丙二醛（MDA），造成膜系統(tǒng)損傷，加速種子衰老死亡。含水量3.7%的種子在劣變過程中積累的MDA量明顯少于含水量6.6%和9.8%的種子，表示低含水量的種子膜脂過氧化程度較輕，所受毒害作用較小。

2.5 人工劣變對(duì)蒙古黃芪種子貯藏物質(zhì)的影響

如圖5A所示，不同含水量蒙古黃芪種子在劣變過程中可溶性糖含量變化趨勢(shì)不一致，含水量3.7%和9.8%的種子可溶性糖含量隨劣變時(shí)間延長先升高后降低，含水量6.6%的種子在劣變過程中可溶性糖含量先下降后升高再降低。在劣變0 d時(shí)，含水量3.7%的種子可溶性糖含量顯著高于含水量9.8%的種子（P＜0.05），含水量6.6%的種子居中；劣變3 d時(shí)，含水量6.6%和9.8%的種子可溶性糖含量無顯著差異，且顯著低于含水量3.7%的種子（P＜0.05）；劣變6 d時(shí)，不同含水量的種子可溶性糖含量均有顯著差異（P＜0.05），可溶性糖含量從高到低依次為含水量6.6%，3.7%，9.8%的種子；劣變12 d時(shí)，含水量3.7%和6.6%的種子可溶性糖含量無顯著差異，且均顯著高于含水量9.8%的種子（P＜0.05）。

如圖5B所示，隨著劣變時(shí)間的延長，蒙古黃芪種子可溶性蛋白含量總體呈下降趨勢(shì)。在劣變0和6 d時(shí)，不同含水量的種子可溶性蛋白含量無顯著差異；劣變3 d時(shí)，含水量6.6%和9.8%的種子可溶性蛋白無顯著差異，且均顯著低于含水量3.7%的種子（P＜0.05）；劣變12 d時(shí)，含水量3.7%的種子可溶性蛋白含量顯著高于含水量9.8%的種子，二者與含水量6.6%的種子無顯著差異。

圖5 控制劣變對(duì)不同含水量蒙古黃芪種子貯藏物質(zhì)含量的影響Fig. 5 The effect of CDT on the content of storage substance of A.mongholicus seeds with different water content

種子中有著豐富的貯藏物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、碳水化合物，脂質(zhì)等 ，在種子衰老過程中這些貯藏物質(zhì)含量會(huì)發(fā)生變化。可溶性糖和蛋白質(zhì)分別作為呼吸底物和氮源，為種子萌發(fā)提供必需條件，多數(shù)研究表明隨著種子老化其含量下降。且貯藏物質(zhì)下降幅度與含水量有關(guān)，與含水量3.7%和6.6%的種子相比，含水量9.8%的種子其可溶性糖和可溶性蛋白含量下降較多，可能是由于含水量高的種子其體內(nèi)過氧化作用較強(qiáng)，貯藏物質(zhì)降解速度較快。

3 討論與結(jié)論

種子活力的喪失主要受貯藏環(huán)境的濕度和溫度這兩大因素的影響，所以種子含水量的高低對(duì)于種子貯藏來說至關(guān)重要。有研究表明，種子含水量在5%～14%范圍內(nèi)每降低1%，種子壽命延長1倍［7］。本試驗(yàn)通過人工劣變研究不同含水量的蒙古黃芪種子劣變過程中活力喪失的特性發(fā)現(xiàn)，隨著劣變時(shí)間的延長，不同含水量種子發(fā)芽率均逐漸降低，且種子發(fā)芽率與含水量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。種子劣變?cè)谖⒂^上是一個(gè)漸變且復(fù)雜的生理生化過程，被普遍認(rèn)可的種子衰老的“自由基學(xué)說”認(rèn)為種子內(nèi)會(huì)不斷產(chǎn)生活性氧造成細(xì)胞成分的氧化降解，最終導(dǎo)致種子死亡［8］。活性氧（ROS）包括超氧陰離子、羥自由基、單線態(tài)氧和過氧化氫等，參與種子生長發(fā)育的整個(gè)過程，一般認(rèn)為活性氧是植物受脅迫時(shí)產(chǎn)生的有害代謝物，會(huì)損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能［9-10］。Pukacka［11］的研究表明活性氧和種子活力密切相關(guān)，活性氧含量會(huì)隨時(shí)間積累，且在高溫高濕條件下加速這個(gè)累積過程。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蒙古黃芪種子在劣變過程中超氧陰離子產(chǎn)生速率隨劣變時(shí)間延長整體呈不斷上升趨勢(shì)，與方嬌陽［12］在香椿種子老化研究中結(jié)果一致，且含水量高的種子超氧陰離子產(chǎn)生速率增幅更大。

植物種子內(nèi)含有SOD和AsA-GSH循環(huán)酶（APX、DHAR、MDHAR、GR）等抗氧化酶，抗氧化酶活性與種子自身代謝及逆境脅迫有密切關(guān)系，這些酶可以清除種子內(nèi)的活性氧，構(gòu)成抵御氧化逆境的屏障，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的平衡。SOD是清除活性氧的第一道防線，它可以將超氧陰離子歧化為過氧化氫。在劣變0～3 d，超氧陰離子產(chǎn)生速率增加引起SOD活性迅速上升，在劣變后期由于超氧陰離子的不斷積累，SOD活性也保持較高水平，這與大多數(shù)關(guān)于種子劣變后SOD活性下降的研究結(jié)果不一致［13-15］，但與吳聚蘭［16］在大豆劣變研究中結(jié)果趨勢(shì)一致。

在AsA-GSH循環(huán)中APX催化H2O2與ASA反應(yīng)生成H2O和MDHA，MDHA一部分被MDHAR還原為AsA，另一部分被歧化生成DHA，再被DHAR還原為AsA，以此清除種子細(xì)胞內(nèi)H2O2，GR使大部分谷胱甘肽處于還原狀態(tài)，為活性氧清除提供還原力［17］。本試驗(yàn)中劣變0～3 d時(shí)，含水量為3.7%和6.6%的種子中APX、DHAR、MDHAR、GR活性提高，一定程度上清除了H2O2，其含量只有小幅提高；而含水量9.8%的種子APX活性下降，H2O2清除能力下降導(dǎo)致H2O2積累較多，進(jìn)而使膜脂過氧化程度增高導(dǎo)致其發(fā)芽率低于含水量3.7%的種子。劣變6～12 d時(shí)，抗氧化酶（APX、DHAR、MDHAR、GR）活性不斷下降，ROS（O2-和H2O2）逐漸積累，攻擊核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，同時(shí)膜脂過氧化程度加劇，細(xì)胞遭受損害，表現(xiàn)為可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量下降［18］，MDA含量不斷上升，種子活力快速喪失，與夏方山［19］在燕麥劣變研究中類似。

含水量與種子劣變速度聯(lián)系密切，本試驗(yàn)中相比高含水量種子，低含水量的種子在劣變過程中活性氧含量較低，抗氧化酶活性較高，MDA含量較低，可溶性蛋白含量較高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激能力而使種子活力更強(qiáng)、發(fā)芽率更高。分析這種現(xiàn)象可能是與種子生理代謝活動(dòng)強(qiáng)弱相關(guān)，含水量高的種子生理代謝活動(dòng)強(qiáng)，在高溫條件下劣變快，含水量低的種子生理代謝活動(dòng)弱，劣變速度慢［20］。且當(dāng)種子含水量低于5%時(shí)，種子水合程度極低，組織的物理狀態(tài)黏性高呈“玻璃態(tài)”，當(dāng)細(xì)胞成分處于“玻璃態(tài)”時(shí)，限制了分子的流動(dòng)，這種惰性的相對(duì)穩(wěn)定的玻璃化狀態(tài)能極大的減慢有害化學(xué)反應(yīng)的速率，延長干燥種子的壽命［21］。

綜上所述，可以得出：(1)隨著劣變時(shí)間延長，不同含水量種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢(shì)，且與含水量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。(2)隨著劣變時(shí)間延長，不同含水量種子的活性氧含量均呈上升趨勢(shì)，抗氧化酶除 SOD 活性升高外，APX、DHAR、MDHAR，GR活性均整體呈下降趨勢(shì)。MDA含量隨劣變時(shí)間呈上升趨勢(shì)，可溶性糖和可溶性蛋白含量呈下降趨勢(shì)。(3)低含水量黃芪種子抗氧化能力和抵御外界刺激能力高于高含水量黃芪種子，因此超干含水量3.7%比6.6%和9.8%更適宜黃芪種子貯藏。