劉玉晴，蘭金蘋，燕高偉，王田幸子，朱 崢，李莉云，劉國振，竇世娟

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北保定 071001）

水稻（Oryza sativaL.）是世界上最重要的糧食作物之一，世界近一半的人口以水稻為主食［1］。但是，水稻生產(chǎn)經(jīng)常遭受到各種病原菌的侵染，其中由水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）引起的白葉枯病是嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的細(xì)菌性病害之一，可導(dǎo)致水稻的嚴(yán)重減產(chǎn)［2］。在過去的20年中，人們對水稻進(jìn)行了廣泛的遺傳和基因組研究，以闡明水稻對Xoo反應(yīng)的分子機(jī)制，已經(jīng)鑒定了40多種對Xoo具有抗性的抗性基因（Resistant gene, R）［3］，其中的11種已經(jīng)被克隆，即Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa10，xa13，Xa21，Xa23，xa25，Xa27和xa41［4］。Xa21是第一個被克隆的抗白葉枯病基因，具有廣譜的抗性［5］。1995年，宋文源等人發(fā)現(xiàn)攜帶Xa21的水稻轉(zhuǎn)基因植株明顯增強(qiáng)了對Xoo的抗性。本實驗室吳瓊等人對攜帶有Xa21抗性基因的水稻植株進(jìn)行接菌，發(fā)現(xiàn)隨著接菌時間的延長OsPR1A、OsPR1B和OsPR10A 3種蛋白質(zhì)表達(dá)量增多，并且在接菌后144 h與接菌的野生型水稻相比，發(fā)現(xiàn)3種蛋白質(zhì)表達(dá)量均高于野生型水稻，表明OsPR1A、OsPR1B和OsPR10A可能參與了Xa21介導(dǎo)的抗病反應(yīng)途徑［6］。近期，本實驗室又證明了OsPR1a-RNAi水稻植株降低了Xa21介導(dǎo)的抗白葉枯病的抗性反應(yīng)（待發(fā)表）。OsPR1a在RNA水平上受到稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae,M.grisea）和水稻白葉枯病菌侵染后誘導(dǎo)表達(dá)，所以O(shè)sPR1a經(jīng)常作為抗病反應(yīng)發(fā)生的標(biāo)記基因［7-8］。

在水稻抗性反應(yīng)中，植物激素作為信號分子也發(fā)揮著重要的作用。植物激素是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及應(yīng)對外界脅迫的重要活性物質(zhì)。當(dāng)植物遭受到病原菌侵染后體內(nèi)會產(chǎn)生一系列植物激素，其中茉莉酸（Jasmonic acid, JA）和水楊酸（Salicylic acid, SA）是與防御相關(guān)的主要植物激素［9］，其他植物激素，例如乙烯（Ethylene, ET），脫落酸（Ascisic acid, ABA），生長素（Auxin, IAA），赤霉素（Gibberellins, GAs），細(xì)胞分裂素（Cytokinin,CKs）和油菜素類固醇（Brassinosteroids, BRs）也參與防御反應(yīng)［9］。MeJA，SA，ET，ABA處理水稻離體葉片發(fā)現(xiàn)OsPR1a基因受到誘導(dǎo)表達(dá)［7,10］。多項研究表明，JA（包括MeJA）是重要的信號分子，在水稻的防御反應(yīng)中起著重要作用［11-12］。水稻丙二烯氧合酶OsAOS是JA生物合成途徑中一個關(guān)鍵的酶，超表達(dá)OsAOS的水稻植株中內(nèi)源JA水平升高，OsPR1a等病程相關(guān)蛋白質(zhì)基因表達(dá)量增加，并且增強(qiáng)了對稻瘟病的抗性，表明JA在水稻病程相關(guān)基因的誘導(dǎo)和抗稻瘟病中起著重要作用［11］。OsCOI1，作為JA的受體，敲除后降低了水稻對白葉枯病和稻瘟病的抗性［12］。WRKY72減弱了水稻對白葉枯病的抗病性，WRKY72與AOS1的W-Box結(jié)合并且在其靶位點誘導(dǎo)DNA超甲基化抑制其轉(zhuǎn)錄，引起內(nèi)源JA水平降低。而SAPK10是ABA誘導(dǎo)的SnPK2型激酶，會磷酸化WRKY72的Thr129位點，從而削弱WRKY72對AOS1轉(zhuǎn)錄的抑制［13］。使用Xoo分泌的細(xì)胞壁纖維素降解酶、脂酶/酯酶預(yù)先處理水稻葉片12 h，隨后接菌Xoo可以提高水稻對Xoo的抵抗力，并上調(diào)JA生物合成基因和JA響應(yīng)基因的表達(dá)［14］。OsMPK15負(fù)調(diào)控SA和JA信號介導(dǎo)的水稻對稻瘟病菌和白葉枯病菌的抗性反應(yīng)。水稻敲除突變體mpk15中病程相關(guān)基因組成型表達(dá)，SA和JA以及SA和JA合成相關(guān)基因表達(dá)累積，增強(qiáng)了對稻瘟病和白葉枯病的抗性［15］。MeJA、SA和病原菌可誘導(dǎo)WRKY30基因表達(dá)，超表達(dá)WRKY30引起JA合成相關(guān)基因（LOX和AOS2）、病程相關(guān)基因（PR3和PR10/PBZ1）的轉(zhuǎn)錄水平升高以及內(nèi)源JA積累增加，增強(qiáng)了水稻對白葉枯病和稻瘟病的抗性［16］。

由此可見，某些植物激素和抗病基因可通過提高OsPR1A表達(dá)來實現(xiàn)抗病的目的。本研究基于抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)策略［17］，從蛋白質(zhì)水平上系統(tǒng)研究植物激素JA、水稻病程相關(guān)蛋白OsPR1A和水稻抗白葉枯病之間的關(guān)系，通過調(diào)控激素、抗病基因和超表達(dá)OsPR1A以期達(dá)到廣譜抗性的目的。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

野生型水稻TP309（Oryza sativaL.）以水稻TP309為背景轉(zhuǎn)入Xa21基因的4021；以4021為背景轉(zhuǎn)入OsPR1a-RNAi的轉(zhuǎn)基因植株#351和#352。水稻材料均種植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)。

1.2 水稻激素處理

水稻離體葉片激素處理：選取飽滿的水稻種子浸泡在30 ℃水中3 d，種子露白后將種子種植到營養(yǎng)土中（營養(yǎng)土與蛭石的比例為1∶1），水稻幼苗培養(yǎng)至4周，將葉片剪其長度為2 cm大小，分別浸泡到濃度為100 μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol/L水楊酸（SA）、100 μmol/L脫落酸（ABA）和1 mmol/L乙烯利（ET）溶液中，在30 ℃ 光照12 h / 黑暗12 h的光周期培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取材時間點為0、2、4和6 d，取材完成后將樣品放入裝有鋼珠的離心管中，然后迅速將樣品置于液氮中，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

水稻活體幼苗激素處理：水稻萌發(fā)后培養(yǎng)5 d，用100 μmol/L MeJA（含0.05% Tween-20）外 源噴施水稻苗至水珠滴下，以不含MeJA的0.05%Tween-20溶液為對照處理水稻幼苗，在30 ℃ 光照12 h / 黑暗12 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取材時間點為0、2、4、8、12、18、24、36和48 h，取材 完成后將樣品放入裝有鋼珠的離心管中，然后迅速將樣品置于液氮中，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 水稻白葉枯病菌Xoo的培養(yǎng)和接菌處理

選取XooPhilippine Race 6（PR6）菌株在土豆培養(yǎng)基（PDA）上劃線培養(yǎng)，溫度為28 ℃，培養(yǎng)2～3 d后，用無菌水稀釋菌液濃度為OD600=0.5，備用。

水稻幼苗接菌處理：水稻萌發(fā)后在27 ℃，光照15 h / 黑暗9 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，用100 μmol/L MeJA（含0.05% Tween-20）噴灑水稻葉片，以不含MeJA的0.05% Tween-20溶液為對照，處理48 h后采用剪葉尖的方法進(jìn)行接菌Xoo，然后觀察表型。

1.4 水稻總蛋白質(zhì)提取

將保存在-70 ℃超低溫冰箱的樣品取出，迅速置于液氮中，然后用高速震蕩研磨儀研磨樣品至粉末狀；每0.1 g樣品粉末中加入1 mL蛋白質(zhì)提取緩沖液；渦旋混勻30 s冰上放置2 min，重復(fù)5次；4 ℃ 12 000 r/min離心20 min；取上清液，加入上清液體積1/4的5×Loading Buffer；煮沸10 min，總蛋白質(zhì)樣品提取完成，-20 ℃儲存?zhèn)溆茫?8］。

1.5 免疫印跡雜交檢測

用10% Tricine膠分離已提取好的水稻總蛋白質(zhì)樣品；電泳條件為80 V，20 min和160 V，90 min；分離完成后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；一抗為anti-OsPR1A多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗；OsHSP82作為校準(zhǔn)上樣量內(nèi)參蛋白，一抗為OsHSP82單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗［19］；WB檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物激素處理水稻離體葉片對OsPR1A表達(dá)的影響

分別用不含激素的水溶液作為對照處理（CK）和用100 μmol/L MeJA、100 μmol/L SA、100 μmol/L ABA和1 mmol/L ET不同激素處理水稻4021的離體葉片。WB檢測發(fā)現(xiàn)，如圖1-a，對照樣品在水稻葉片離體處理后2、4 和6 d時OsPR1A表達(dá)增加，說明OsPR1A蛋白質(zhì)受到機(jī)械傷害的誘導(dǎo)表達(dá)；在MeJA處理中，OsPR1A同樣在第2天開始誘導(dǎo)表達(dá)，4和6 d時與對照相比受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)。在SA處理的水稻離體葉片中，與對照相比，機(jī)械傷害導(dǎo)致的OsPR1A誘導(dǎo)表達(dá)在前期被抑制（圖1-b）。在ABA處理中，OsPR1A表達(dá)受到抑制（圖1-c）。在ET處理中，與對照相比，OsPR1A表達(dá)豐度呈上升趨勢（圖1-d）。

圖1 水稻離體葉片不同激素處理后在不同時間點OsPR1A的表達(dá)情況Fig. 1 Expression of OsPR1A at different time points after treated with different hormones in detached rice leaves

2.2 外源MeJA處理水稻幼苗對OsPR1A表達(dá)的影響

在離體水稻4021葉片中發(fā)現(xiàn)：OsPR1A在處理后第2 天受到機(jī)械傷害和100 μmol/L MeJA的誘導(dǎo)。在此基礎(chǔ)上，利用土培5 d的水稻活體幼苗，用100 μmol/L MeJA噴施水稻葉片后，于0、2、4、8、12、18、24、36和48 h時間點取樣，以探究在水稻活體組織中噴施MeJA后對OsPR1A表達(dá)的影響。經(jīng)WB檢測發(fā)現(xiàn)，水稻幼苗地上部在對照和MeJA處理中OsPR1A均不表達(dá)（圖2-a，2-b）。用水作為對照處理水稻葉片后，在水稻幼苗根部，OsPR1A呈組成型表達(dá)（圖2-c）；用100 μmol/L MeJA處理水稻葉片后，OsPR1A從處理8 h在根部開始誘導(dǎo)表達(dá)并隨著時間延長表達(dá)量增加（圖2-d）。在整個活體水稻植株中，葉片噴施MeJA并沒有引起在離體葉片中那樣OsPR1A強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)，MeJA信號可能轉(zhuǎn)移到水稻的根部組織，并使根部OsPR1A受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)。OsPR1A在根部呈組成型表達(dá)，說明OsPR1A可能參與了水稻根系正常生長發(fā)育過程。MeJA誘導(dǎo)根部OsPR1A的表達(dá)，暗示著MeJA可能參與了調(diào)控水稻的抗逆能力。

圖2 水稻幼苗中MeJA處理葉片后在不同部位和不同時間點OsPR1A的表達(dá)情況Fig. 2 Expression of OsPR1A at different parts and different time points after treated with MeJA in leaves of rice seedings

2.3 外源MeJA處理野生型水稻對Xoo的抗性

為了進(jìn)一步調(diào)查在病原菌存在情況下，MeJA誘導(dǎo)的OsPR1A表達(dá)與水稻抗性之間的關(guān)系，分別用不含MeJA的水溶液作為對照處理和用100 μmol/L MeJA的溶液噴施處理野生型水稻TP309的葉片，處理48 h后采用剪葉片法接種Xoo，接種菌后0、2、4、6和8 d進(jìn)行取材，并于接菌后8 d觀察病斑大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用100 μmol/L MeJA預(yù)處理后再接種Xoo的水稻葉片與對照相比病斑長度縮短，平均縮短約1.5 cm（圖3-a）。WB檢測結(jié)果顯示，在TP309水稻中，對照處理條件下，OsPR1A在8 d內(nèi)沒有OsPR1A的誘導(dǎo)條帶出現(xiàn)；在MeJA處理條件下，OsPR1A在接菌第6 天有誘導(dǎo)條帶出現(xiàn)，第8天時表達(dá)量明顯增加（圖3-b）。說明外源MeJA處理水稻幼苗可以提前誘導(dǎo)OsPR1A的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)了水稻對Xoo的抗性。

圖3 MeJA處理對病斑長度和OsPR1A表達(dá)的影響Fig. 3 Effects on the lesion length and OsPR1A expression of MeJA treatment

2.4 外源MeJA處理的轉(zhuǎn)基因OsPR1a-RNAi水稻對病斑的影響

用100 μmol/L MeJA預(yù)處理水稻OsPR1a-RNAi轉(zhuǎn)基因株系351和352，處理48 h后接種Xoo，接菌12 d后觀察表型（見圖4）。

圖4 MeJA處理OsPR1a-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻對病斑長度的影響Fig. 4 Effect on the lesion length of MeJA-treated OsPR1a-RNAi transgenic rice

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeJA預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因株系351和352，與未經(jīng)處理的351和352相比，病斑長度縮短；351+MeJA長度居于4021與351之間（圖4-a），352+MeJA長度居于4021與352之間（圖4-b）。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeJA預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因株系病斑長度顯著低于未處理的轉(zhuǎn)基因株系（P＜ 0.05）（圖4-c,圖4-d）。結(jié)果表明，通過外施MeJA，可以減弱OsPR1a-RNAi植株對Xoo的敏感性。

3 討論與結(jié)論

植物的抗性水平受到植物激素介導(dǎo)的系統(tǒng)信號的影響。在雙子葉模式植物擬南芥中，植物激素在先天免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，因此得到廣泛的研究；然而，直到最近10年，在單子葉模式植物水稻（Oryza sativaL.）中才被證實植物激素在免疫反應(yīng)中起著保守作用［12］。研究表明，JA是抵抗壞死型病原體所必需的，而SA是抵抗生物營養(yǎng)型病原體所必需的［20］。在擬南芥中，JA與SA以拮抗的方式相互作用，JA與ET呈協(xié)同作用［21］。在水稻中，OsNPR1作為SA的受體，超表達(dá)該基因后JA相關(guān)應(yīng)答基因表達(dá)下調(diào)，使水稻植株更容易受到昆蟲等食草動物的危害［22］。外源MeJA、SA和ET處理水稻離體葉片，OsPR1a基因受到誘導(dǎo)表達(dá)，其中MeJA處理的OsPR1a轉(zhuǎn)錄水平明顯高于SA處理的樣品［12］。本研究結(jié)果表明，OsPR1A受JA和ET的誘導(dǎo)，而ABA則抑制其表達(dá)，SA則以前期有一定的抑制作用。說明OsPR1A可能主要參與在JA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中而并非SA途徑。研究發(fā)現(xiàn)，植物激素ABA主要參與防御反應(yīng)的調(diào)控和整合，ABA可能充當(dāng)了植物防御的負(fù)調(diào)節(jié)劑［12］。外施ABA或低溫處理會降低水稻對稻瘟病的抗性，而外用ABA合成抑制劑處理水稻會阻止低溫導(dǎo)致的稻瘟病敏感性［23-24］。水稻OsERF922受ABA快速而強(qiáng)烈地誘導(dǎo)，超表達(dá)后防御相關(guān)基因（PR1a，PR1b，PR10，PAL）的表達(dá)減少，ABA的內(nèi)源水平增加，并且降低了對稻瘟病的抗性，因此，ABA可能會通過調(diào)控OsPR1A在水稻免疫應(yīng)答中起負(fù)調(diào)控作用。

本實驗室前期研究表明，OsPR1A不僅受Xoo的誘導(dǎo)［6］，而且還受光的誘導(dǎo)［25］。光對植物生命至關(guān)重要，對光環(huán)境的感知往往是通過激素水平和信號傳遞的變化影響植物的生長發(fā)育。光信號可以通過光敏色素（phy）將信號傳遞給下游蛋白，激活植物的防御反應(yīng)。不耐蔭植物通過光敏色素B（phyB）激活避蔭反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)與生長相關(guān)的激素途徑并減弱JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)［26］。在phyAphyBphyC突變體中與野生型水稻相比，JA途徑相關(guān)基因（LOX2，AOS2）和病程相關(guān)基因（PR1a，PR1b）表達(dá)水平降低［27］。結(jié)合本試驗結(jié)果，OsPR1A可能參與了光信號引起的JA防御反應(yīng)，即光-JA-OsPR1A信號途徑在植物防御應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。

病程相關(guān)蛋白質(zhì)OsPR1a屬于PR1家族成員，編碼酸性蛋白質(zhì)，屬于類絲氨酸羧肽酶［12,28］。研究發(fā)現(xiàn)，在離體葉片中傷害可以誘導(dǎo)OsPR1a的表達(dá)，并且在JA與傷害同時存在的情況下可以強(qiáng)烈的誘導(dǎo)OsPR1a的表達(dá)，表明JA可能參與了水稻應(yīng)對傷害脅迫的防御反應(yīng)［12,28］。JA處理野生型水稻TP309和轉(zhuǎn)基因水稻OsPR1a-RNAi幼苗后均會降低它們對Xoo的敏感性，呈現(xiàn)一定的抗病性，而OsPR1A超表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合植株增強(qiáng)了水稻對Xoo的抗性（待發(fā)表）。OsPR1A在水稻苗期地上部不表達(dá)，在根中組成型表達(dá)，外施MeJA處理后OsPR1A在根部隨著時間延長表達(dá)量增加。本研究結(jié)果表明，水稻在沒有受到脅迫的情況下，JA誘導(dǎo)的根部OsPR1A表達(dá)可能參與了水稻根系的營養(yǎng)和發(fā)育過程。而葉片受到傷害或病原菌侵染時，外源MeJA處理水稻幼苗葉片，會激活葉片在傷害部位或侵染部位獲得局部抗性，誘導(dǎo)OsPR1A表達(dá)增加，增強(qiáng)了水稻對白葉枯病菌的抗性。

總之，植物的抗病反應(yīng)是一個綜合協(xié)調(diào)，多因素互作的結(jié)果，涉及到光照、溫度、生長發(fā)育階段、抗性基因和激素等。以外施MeJA為線索，通過誘導(dǎo)OsPR1A的大量表達(dá)，可以進(jìn)一步梳理水稻抗白葉枯病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中MAPK-WRKY-PR之間的具體關(guān)系。通過抗病信號途徑的探究，達(dá)到獲得廣譜抗性的方法。