王洪玲，李秋月，陳秋彤，劉 川，趙 芡，張英睿，張 藝，沈曉飛，張 靜

（成都中醫(yī)藥大學(xué)1.民族醫(yī)藥學(xué)術(shù)傳承創(chuàng)新研究中心，2.民族醫(yī)藥學(xué)院，3.藥學(xué)院，4.附屬醫(yī)院，四川 成都 611137）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬于藏醫(yī)“真布病”范疇，其病程長，病源廣，致殘率高，預(yù)后差，在藏醫(yī)研究中備受關(guān)注［1］。藏藥西藏貓乳又叫“森等”，藏語稱為畢曾興，為鼠李科貓乳屬植物西藏貓乳（Rhamnella gilgitica Mansf.et Melch.）莖的干燥木質(zhì)部（俗稱心材），為藏醫(yī)治療RA 常用藥物之一［2-3］?！端牟酷t(yī)典》［4］記載：“森等涼血，斂干黃水”?！毒е楸静荨罚?］謂：“森等燥血，干黃水”。《藏藥志》［6］中亦明確指出，“森等涼、燥、濕；能活血，干黃水，治麻風(fēng)病?！薄缎l(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》記載西藏貓乳味苦，性涼，具有涼血、消腫的功效，用于治療RA、黃水病，高山多血癥，常外敷于患處［7］?！秾?shí)用藏藥名庫》中記載了以西藏貓乳為君藥的6種常用于治療關(guān)節(jié)腫痛的常用方劑，分別是貓乳獨(dú)味湯、四味貓乳湯散、七味貓乳藥酥油、九味貓乳藥酥油、二十三味貓乳散和二十五味貓乳丸［8］。

西藏貓乳含有墨沙酮、柚皮素和山奈素等黃酮類及大黃酚、沒食子酸、β-谷甾醇、混合脂肪酸和混合脂肪酸酯等化合物［15-18］；藥理學(xué)研究表明，西藏貓乳具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化等作用，可明顯改善RA癥狀［9-13］。藏醫(yī)臨床上亦有用西藏貓乳為君藥治療關(guān)節(jié)紅腫疼痛等疾病的報(bào)道［14］。但目前對(duì)西藏貓乳研究尚淺，尚未探討其作用機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)西藏貓乳抗RA的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為后期研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

數(shù)據(jù)庫有 UniProt（https：//www.uniprot.org/）（2020-08-03），Drug Bank 5.17（https：//www.drugbank.ca/）（2020-07-02），Therapeutic Target Database（TTD）（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）（2020-01-06），Gene Card-Human Genes 5.0（https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/）（2020-07-27），STRING 11.0（https：//string-db.org/）（2020-01-19），DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）（2020-08-20），Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）（2019-03-01），Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/index.php）（2018-04-05），RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）（2020-07-10），ZINC 15（http：//zinc.docking.org/）（2017-02-09）和 Omi share Tools（http：//www.omicshare.com/tools）（2016-04）。軟件有 Cytoscape3.7.2（http：//www.cytoscape.org/），Maestro version 11.5（https：//www.schrodinger.com/Maestro/）和 Chem Draw Professional 16.0（美國PerkinElmer公司）。

1.2 藥物、試劑和儀器

芹菜素、鼠李檸檬素和山奈素均是本實(shí)驗(yàn)室分離所得（純度均＞98.0%），BAY11-7082（NF-κB抑制劑）購自美國Med Chem Express公司，均用二甲亞砜溶解，配制成200 mmol·L-1的母液，用時(shí)加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。二甲亞砜（純度＞99.5%），成都市科隆化學(xué)品有限公司；胎牛血清、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和DMEM培養(yǎng)基，上海浩然生物技術(shù)有限公司；Griess檢測(cè)試劑盒，美國Promega公司；小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)、Forma3111型水套式CO2培養(yǎng)箱、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Becton Dickinson公司；XDS-IB型倒置生物顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；5424R低溫離心機(jī)，德國Eppendorf；Victor1420型多功能標(biāo)記分析儀，美國Perkin Elmer公司；1/10萬級(jí)Sartorius BP121S電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司。

1.3 西藏貓乳化合物與其抗RA的潛在作用靶點(diǎn)信息篩選

采用Chem Draw Professional 16.0軟件繪制西藏貓乳化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，利用PubChem數(shù)據(jù)庫，將所有的化合物都轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical Smiles格式，將其繼續(xù)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，獲取化學(xué)成分作用靶點(diǎn)信息。

利 用 Drug Bank，TTD（Therapeutic Target Database）和Gene Card-Human Genes數(shù)據(jù)庫以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞搜索疾病靶點(diǎn)，其中Gene Card-Human Genes選擇相關(guān)性得分＞5篩選疾病靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPl）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建PPI圖。

1.5 相關(guān)通路的獲取和“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)建立與分析

將獲得的潛在作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集分析、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。將結(jié)果導(dǎo)入Omi share Tools繪制對(duì)應(yīng)的柱形圖和高級(jí)氣泡圖。以選取化學(xué)成分、預(yù)測(cè)的潛在作用靶點(diǎn)和通路及化學(xué)成分為節(jié)點(diǎn)，建立相互關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，構(gòu)建西藏貓乳“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

篩選出西藏貓乳的主要化學(xué)成分和靶點(diǎn)，借助RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，保存為PDB格式。借助ZINC數(shù)據(jù)庫下載化學(xué)成分3D結(jié)構(gòu)的mol格式文件。將主要作用靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入軟件Maestro version 11.5軟件進(jìn)行去水、加氫、能量最小化等操作，運(yùn)用glide進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能值評(píng)價(jià)受體與配體匹配的穩(wěn)定性。

1.7 MTT法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞存活率

用含有10%胎牛血清的DMEM作為培養(yǎng)基，將RAW264.7巨噬細(xì)胞于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)（2～3 d傳代1次）。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以2.5×108L-1接種到96孔板內(nèi)，每孔100 μL，每組設(shè)6復(fù)孔，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，除細(xì)胞對(duì)照組加入100 μL完全培養(yǎng)基代替藥物外，山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素組分別給予含藥（藥物濃度為5，10，20，50，100和200 μmol·L-1）培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h。棄上清后，每孔加入100 μL MTT溶液（5 g·L-1），4 h后終止培養(yǎng)，每孔加100 μL二甲亞砜避光低速振蕩10 min，于590 nm波長處測(cè)定吸光度A590nm。細(xì)胞存活率（%）=藥物組A590nm/細(xì)胞對(duì)照組A590nm×100%。

1.8 Griess法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮（nitric oxide，NO）釋放量

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細(xì)胞，以2.5×108L-1接種到96孔板內(nèi)，每組設(shè)6復(fù)孔，每孔100 μL，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄上清，除細(xì)胞對(duì)照組和LPS組加入不含藥物的培養(yǎng)液100 μL外，BAY11-7082組加入含BAY11-7082（濃度為5 μmol·L-1）的培養(yǎng)液 100 μL；山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素組分別加入含山奈素、鼠李檸檬素或芹菜素（藥物濃度為5，10，20，50和100 μmol·L-1）的培養(yǎng)液100 μL預(yù)處理2 h后，除細(xì)胞對(duì)照組外，其余各組均加入LPS（濃度為0.5 mg·L-1）10 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后吸取各孔細(xì)胞上清液，按Griess試劑盒方法測(cè)定上清液中NO含量。

2 結(jié)果

2.1 西藏貓乳化合物與其抗RA的潛在作用靶點(diǎn)信息篩選

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，西藏貓乳化學(xué)成分有21個(gè)［2，11，15-17］，前期課題組分離得到 17 個(gè)［18］，除去相同化學(xué)成分，共有34個(gè)化學(xué)成分（表1）。使用Chem Draw Professional 16.0軟件繪制34個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，將化合物以Canonical Smiles格式導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫并設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，獲取化學(xué)成分作用靶點(diǎn)信息。按1.3方法，整合除去重復(fù)靶點(diǎn)，得疾病靶點(diǎn)。將預(yù)測(cè)得到的化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，得到化學(xué)成分作用的潛在靶點(diǎn)68個(gè)（表1）。

Tab.1 lnformation on 68 potential targets of 34 chemical constituents in Rhamnella gilgitica Mansf.et Melch（RG）

Tab.1(continued)

2.2 “化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)建立與分析

將與西藏貓乳化學(xué)成分作用的68個(gè)潛在作用靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫分析，得到靶標(biāo)蛋白參與的所有途徑，篩選出靶標(biāo)蛋白顯著參與途徑（P＜0.05），共篩選出80條顯著代謝途徑，通過Cyto-scape3.7.2軟件構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”見圖1。共有177個(gè)節(jié)點(diǎn)和827條邊，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選等級(jí)值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些連接化合物或靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵的化合物或者靶點(diǎn)。

Fig.1 Components-targets-KEGG pathway network of RG against RA.68 potential targets were analyzed by DAVID database，and 80 related pathways were obtained（P＜0.05）.The 29 chemical components，68 potential targets and 80 pathways obtained were imported to Cytoscape 3.7.2 software to obtain the network of“Components-targets-KEGG pathways”.The yellow circle represents 29 chemical components，the green circle represents 68 potential targets，and the purple square represents 80 KEGG pathways.

以“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖設(shè)置等級(jí)值（degree）≥14為核心化學(xué)成分，篩選出9個(gè)主要化學(xué)成分，可能為西藏貓乳活性成分，分別為Tristin、1，2-二（4-羥基苯基）乙烷、柚皮素、槲皮素、（-）-南燭木樹脂酚、鼠李檸檬素、山奈素、芹菜素和大黃酚；通過選取degree≥22為潛在作用靶點(diǎn)，得到9個(gè)靶點(diǎn)，分別為原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（protooncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）、胰島素樣生長因子1受體（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、人源重組蛋白R(shí)ELA、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，Akt1）、磷脂酰肌醇-3 激酶催化亞基 δ（phosphoinositide-3 kinase，catalytic subunit delta，PIK3CD）和磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）；通過關(guān)聯(lián)的80條通路分析，發(fā)現(xiàn)西藏貓乳化學(xué)成分作用靶點(diǎn)涉及疼痛、炎癥和RA等相關(guān)調(diào)節(jié)通路。

2.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將2.1通過Swiss Target Prediction，Drug Bank和TTD等數(shù)據(jù)庫篩選的68個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，上傳到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，并將物種限定為“Homo sapiens”，下載標(biāo)簽分隔值文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化展示得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

Fig.2 Protein-protein interaction（PPl）network of potential targets of RG for RA intervention.The 68 potential targets were uploaded to the STRING 11.0 database，and the Tab Separated Values（TSV）file was obtained via limiting species to“Homo sapiens”.The TSV file was imported into Cytoscape 3.7.2 software to analyze the PPI network of 68 potential targets.The circles in the figure from large to small represent the size of degree value，and the larger the circle，the more likely it is a key target.

2.4 靶點(diǎn)通路分析

通過將68個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物學(xué)功能注釋和KEGG通路富集分析，將結(jié)果導(dǎo)入Omi share Tools繪制對(duì)應(yīng)的柱形圖及高級(jí)氣泡圖。得到GO功能富集分析GO條目318個(gè)（P＜0.05），其中生物過程（biological process，BP）條目224個(gè)，細(xì)胞組成（cell composition，CC）條目32個(gè)，分子功能（molecular function，MF）條目62個(gè)，部分條目（靶點(diǎn)數(shù)≥10）（圖3）。KEGG通路富集篩選得到80條信號(hào)通路（P＜0.05），選取（P＜0.02，count≥5）前25個(gè)通路利用氣泡圖進(jìn)行可視化（圖4）。富集結(jié)果分析得知，西藏貓乳化學(xué)成分作用靶點(diǎn)涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、疼痛、炎癥等相關(guān)調(diào)節(jié)通路。

Fig.3 Enrichment analysis of Gene Ontology（GO）biological process of RG on potential targets for intervention of RA.GO function enrichment analysis was performed through DAVID，and the histograms map was plotted by Omic share database for visualization.Biological process（BP），cell composition（CC）and molecular function（MF），the red line is the P value of the GO entry.And the GO items are on the left side of the graph，the count represents the number of genes.

Fig.4 Enrichment analysis of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway of RG on potential target for intervention of RA.KEGG pathway enrichment analysis was performed through DAVID，and bubble map was plotted by Omic share database for visualization.The KEGG pathways are on the left side of the graph，and the count represents the number of genes enriched in the KEGG.The size of the circle represents the number of genes enrichments，and the color represents the P value.

2.5 西藏貓乳分子對(duì)接驗(yàn)證

對(duì)GO富集分析靶點(diǎn)排列前10的條目靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，選出9個(gè)出現(xiàn)頻率較高的潛在作用靶點(diǎn)，分別為雄激素受體（androgen receptor，AR）、EGFR、IGF1R、熱休克蛋白 90AA1（heat shock protein 90AA1，HSP90AA1）、SRC、MAPK8、Akt1、PIK3R1和RELA，與9個(gè)主要化學(xué)成分Tristin、1，2-二（4-羥基苯基）乙烷、柚皮素、槲皮素、（-）-南燭木樹脂酚、鼠李檸檬素、山奈素、芹菜素和大黃酚進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能值評(píng)價(jià)受體與配體匹配的穩(wěn)定性。將上述9個(gè)主要化學(xué)成分與9個(gè)潛在作用靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表2。

一般認(rèn)為進(jìn)行分子對(duì)接時(shí)配體和受體的結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大，結(jié)合能＜0說明配體和受體可以自發(fā)結(jié)合［19］。表2結(jié)果顯示，其中鼠李檸檬素與AR、芹菜素與HSP90AA1和IGF1R、柚皮素與MAPK8、EGFR和RELA、山柰素與SRC、Tristin與Akt1、槲皮素與PIK3R1結(jié)合能最小，構(gòu)象穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性大，其中芹菜素和柚皮素潛在作用靶點(diǎn)多，分子對(duì)接模式見圖5。

Fig.5 Docking results of main compounds and targets in RG.The 3D structure of AR，HSP90AA1，IGF1R，MAPK8，EGFR，SRC，Akt1，PIK3R1 and RELA were imported into Maestro version 11.5 software for molecular docking.The docking mode of the above nine compounds corresponded to nine core targets.The figure represents the docking mode，with 3D mode on the left and 2D mode on the right.

2.6 山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞存活的影響

由表3結(jié)果表明，山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素5～100 μmol·L-1作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞，其細(xì)胞存活率均＞90%，表明山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素在5～100 μmol·L-1無細(xì)胞毒性作用。

Tab.2 Prediction of conjunction of active ingredients and key targets in RG

Tab.3 Effect of kaempferol，apigenin and rhamnocitrin on RAW264.7 cell viability

2.7 山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO釋放的影響

由表4可見，與細(xì)胞對(duì)照組比較，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后RAW264.7巨噬細(xì)胞NO釋放升高（P＜0.05）。在5～100 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素均不同程度抑制了NO的釋放。表明山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

Tab.4 Effect of kaempferol，rhamnocitrin and apigenin on nitric oxide（NO）release induced by lipopolysaccharide（LPS）in 264.7 macrophages

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)，對(duì)“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，從整體層面分析中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制。分子對(duì)接技術(shù)是研究藥物分子和蛋白受體之間的相互作用，并能預(yù)測(cè)配體-受體結(jié)合模式和親和力的一種虛擬篩選方法。本研究整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究藏藥西藏貓乳治療RA的作用機(jī)制。首先本研究在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中查找通過文獻(xiàn)檢索和前期課題組分離得到的西藏貓乳化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，結(jié)合Drug Bank、TTD和Gene Card-Human Genes數(shù)據(jù)庫獲得的RA相關(guān)靶點(diǎn)，篩選出西藏貓乳化學(xué)成分作用的潛在靶點(diǎn)。再采用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析，使用Omi share Tools數(shù)據(jù)庫繪制對(duì)應(yīng)的柱形圖及高級(jí)氣泡圖，然后采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”和PPI網(wǎng)絡(luò)圖。最后采用分子對(duì)接技術(shù)和細(xì)胞抗炎活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得的活性成分進(jìn)行驗(yàn)證。最終獲得6個(gè)核心成分和9個(gè)核心靶點(diǎn)，且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示山奈素、鼠李檸檬素和芹菜素對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO釋放量皆有抑制作用，表明這3個(gè)化合物確有抗炎作用。

通過構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，得到西藏貓乳化學(xué)成分作用相關(guān)的9個(gè)核心靶點(diǎn)，分別是 SRC，mTOR，IGF1R，EGFR，MAPK8，RELA，Akt1，PIK3CD和PIK3R1。同時(shí)，通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)主要作用于血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、MAPK、NF-κB、T細(xì)胞受體和mTOR等信號(hào)通路。研究表明，RA形成過程中NF-κB，MAPK和VEGF等信號(hào)通路均被激活［21-23］。其中，NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、生長因子和氧化應(yīng)激相關(guān)酶等表達(dá)，在細(xì)胞分化、凋亡、黏附、炎癥和免疫應(yīng)答等方面影響RA的發(fā)生和發(fā)展［24］?，F(xiàn)代研究表明，藏藥翼首草通過調(diào)節(jié)MAPK和VEGF信號(hào)通路來抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)，減少膠原蛋白的產(chǎn)生、抑制滑膜細(xì)胞增殖并減弱其侵襲能力，從而發(fā)揮抗RA作用［25］。綜上分析，西藏貓乳可能通過調(diào)節(jié)炎癥、免疫和內(nèi)分泌等通路，發(fā)揮治療RA的作用。

通過分子對(duì)接技術(shù)篩選出評(píng)分最高的活性化學(xué)成分均為黃酮類，分別是鼠李檸檬素、芹菜素、柚皮素、山奈素、槲皮素和Tristin。同時(shí)采用Griess法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO釋放量，驗(yàn)證鼠李檸檬素、山奈素和芹菜素的抗炎活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠李檸檬素、山奈素和芹菜素可有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO的釋放，表明它們具有抗炎作用。黃酮類成分廣泛存在于自然界中，是植物主要活性成分之一，主要通過抑制炎癥因子產(chǎn)生、調(diào)節(jié)信號(hào)通路、抗氧自由基免疫調(diào)劑等達(dá)到治療RA的作用［26］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素具有促成骨作用和抑制破骨作用，具有抗炎、抗過敏和抗菌等作用［27］。王友慶等［28］研究表明，槲皮素可通過抑制NF-κB激活，減弱炎癥環(huán)境下軟骨細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶13產(chǎn)生、基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)軟骨的作用。古秋莉等［29］研究發(fā)現(xiàn)，鼠李檸檬素對(duì)于腫脹、滲出急性炎癥模型和肉芽腫慢性炎癥模型具有一定的抑制作用。山奈素可通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)以及抑制轉(zhuǎn)錄因子激活等方式減少炎癥因子的產(chǎn)生，抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展［30］。慕佳冶［31］研究發(fā)現(xiàn)，山奈素對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎病情有很好的改善作用，其治療大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能與其提高大鼠的抗氧化能力和其免疫調(diào)節(jié)并抑制細(xì)胞炎癥因子有關(guān)。潘東梅［32］通過山奈素對(duì)小鼠RA的治療研究，得出山奈素對(duì)RA滑膜炎癥以及髓后的關(guān)節(jié)破壞均有一定的治療作用。梁清華等［33］研究證明，芹菜素對(duì)T細(xì)胞的增殖及白細(xì)胞介素2，干擾素γ和白細(xì)胞介素4 mRNA表達(dá)具有抑制作用，提示芹菜素具有免疫抑制作用。此外，闞偉娟等［34］研究表明，芹菜素通過下調(diào)一氧化氮合酶蛋白表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α等炎癥細(xì)胞因子從而發(fā)揮抗炎作用。綜合分子對(duì)接、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道等分析，可部分驗(yàn)證本研究網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)西藏貓乳發(fā)揮抗RA的作用與黃酮類化學(xué)成分通過調(diào)節(jié)免疫、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)和血管生成等有關(guān)，與抗RA藥物調(diào)節(jié)通路相符合。

傳統(tǒng)藏醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA主要是由于環(huán)境、飲食、起居行為等不當(dāng)引起機(jī)體“三因”失衡，進(jìn)一步引起代謝失常、功能紊亂，使得黃水增生，侵害肌肉、關(guān)節(jié)甚至骨骼等整個(gè)機(jī)體［35］。藏醫(yī)臨床治療RA以干黃水為原則，通常從飲食、起居行為、藥物和外治4個(gè)方面入手。其中藥物治療主要以內(nèi)服散寒除濕、消腫止痛藥物為主，而西藏貓乳味苦，性涼，具有涼血、消腫之功效，是藏醫(yī)臨床治療RA的常用藥?，F(xiàn)代研究也證明，西藏貓乳對(duì)RA有明確的治療作用。如裴小娜等［11］研究表明，西藏貓乳提取物具有一定的鎮(zhèn)痛抗炎活性，對(duì)RA具有治療作用；Shan等［12］研究發(fā)現(xiàn)，西藏貓乳提取物可有效治療完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎，有望開發(fā)為治療炎癥的藥物；謝敏等［36］通過研究西藏貓乳不同提取部位鎮(zhèn)痛抗炎活性，發(fā)現(xiàn)西藏貓乳總黃酮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有治療作用。朵日毛等［14］報(bào)道，臨床上用西藏貓乳治療關(guān)節(jié)紅腫疼痛多例，確有良效。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)西藏貓乳“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)西藏貓乳抗RA的主要化學(xué)成分為黃酮類，如鼠李檸檬素、芹菜素和山奈素，且這些成分可通過調(diào)節(jié)免疫、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)和血管生成等發(fā)揮抗RA的作用。本研究初步揭示西藏貓乳的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入研究其抗RA作用機(jī)制提供參考。