黃鵬程，王敬亭，3，趙田田，，趙澤浩，，周長(zhǎng)慧，，李若婉，朱春梅，鄭 陽(yáng)，常 艷，

（1.上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201201；3.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203）

在真核細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中，DNA會(huì)因各種內(nèi)在或外來(lái)因素如X射線、環(huán)境污染物和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等發(fā)生損傷。在這些損傷中，DNA雙鏈斷裂是最為嚴(yán)重的損傷之一［1］。在形成DNA雙鏈斷裂數(shù)秒鐘后，斷裂處的組蛋白H2AX被磷酸化。磷酸化后的H2AX被稱為γ-H2AX［1］。研究發(fā)現(xiàn)，γ-H2AX灶點(diǎn)數(shù)與DNA雙鏈斷裂數(shù)成對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，對(duì)γ-H2AX灶點(diǎn)數(shù)的定量檢測(cè)可反映DNA雙鏈斷裂損傷的程度［2］，是檢測(cè)DNA雙鏈斷裂較為敏感的生物標(biāo)志物之一［3］。目前γ-H2AX灶點(diǎn)檢測(cè)已具備快速、準(zhǔn)確和可高內(nèi)涵分析的能力，但仍存在檢測(cè)指標(biāo)單一、假陽(yáng)性率較高、需添加體外代謝活化系統(tǒng)和受細(xì)胞凋亡影響較大的局限［4］。

近年來(lái)，基于多色流式細(xì)胞術(shù)的多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)法，可將多個(gè)遺傳毒性終點(diǎn)生物標(biāo)志物的檢測(cè)整合進(jìn)γ-H2AX灶點(diǎn)檢測(cè)，提高檢測(cè)效率，降低檢測(cè)假陽(yáng)性率，還可以提供化合物作用機(jī)制等更多信息［6］，成為克服當(dāng)前γ-H2AX灶點(diǎn)檢測(cè)缺點(diǎn)的重要方法。

生物標(biāo)志物P53蛋白、磷酸化組蛋白H3（p-H3）和活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）可用于檢測(cè)不同的遺傳毒性終點(diǎn)。P53蛋白是一種調(diào)控細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄因子，可以提供DNA損傷修復(fù)信息；p-H3可以作為非整倍體效應(yīng)的生物標(biāo)志物［5］；活化PARP是胱天蛋白酶的切割底物，可以標(biāo)記胱天蛋白酶高表達(dá)的細(xì)胞。將這幾種生物標(biāo)志物整合到γ-H2AX灶點(diǎn)試驗(yàn)中，不但可以增加試驗(yàn)準(zhǔn)確性，還可以排除胱天蛋白酶誘導(dǎo)的γ-H2AX灶點(diǎn)，降低試驗(yàn)假陽(yáng)性率［6］。

本研究以經(jīng)典的致斷裂劑依托泊苷、環(huán)磷酰胺和非整倍體誘導(dǎo)劑秋水仙素為陽(yáng)性對(duì)照品，以p53基因完整的人成淋巴TK6細(xì)胞為試驗(yàn)體系，建立基于多色流式細(xì)胞術(shù)的多終點(diǎn)組合檢測(cè)遺傳毒性的評(píng)價(jià)方法。最后采用DNA斷裂劑絲裂霉素C、甲磺酸甲酯、苯并芘和順鉑，非整倍體誘導(dǎo)劑長(zhǎng)春新堿和紫杉醇，不具有遺傳毒性的化合物氯化鈉、氨芐青霉素G和鹽酸普萘洛爾對(duì)該方法的靈敏度和特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

人成淋巴TK6細(xì)胞（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)），細(xì)胞復(fù)蘇后在含10%馬血清和L-谷氨酰胺4 mmol·L-1的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在37℃，5% CO2的加濕條件下懸浮培養(yǎng)。每周傳代2～3次，細(xì)胞密度維持在（2～10）×108L-1。依托泊苷、環(huán)磷酰胺、秋水仙堿、絲裂霉素C、甲磺酸甲酯、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、苯并芘、順鉑、氯化鈉、氨芐青霉素G、鹽酸普萘洛爾和RNA酶（Sigma公司，美國(guó)）；RPMI-1640培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺和熱滅活馬血清（Gibco公司，美國(guó)）；CCK-8試劑盒（同仁公司，日本）；細(xì)胞通透/洗滌緩沖液、Alexa Fluor?647 小鼠抗人H2AX（pS139）（貨號(hào)：560447）、PE小鼠抗人P53 Se（tRUO）（貨號(hào)：557027）、FITC標(biāo)記小鼠抗人活化PARP（Asp214）單克隆F21-852抗體（貨號(hào)：558576）、Alexa Fluor?647大鼠抗小鼠p-H3（pS28）單克隆 HTA28（RUO）抗體（貨號(hào)：558217）和7-AAD染液（貨號(hào)：559925）（BD公司，美國(guó)）；大鼠肝S9（Moltox公司，美國(guó)）；6 μm計(jì)數(shù)微珠（賽默飛世爾，美國(guó)）；輔助因子為本實(shí)驗(yàn)室自制；U型底96孔板（康寧公司，美國(guó)）；Accuri?C6流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）。

1.2 受試物溶液和代謝活化系統(tǒng)

二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和無(wú)菌去離子水為受試物和陽(yáng)性對(duì)照藥配制溶劑，并設(shè)為同組溶劑（陰性）對(duì)照（表1）。體外代謝活化系統(tǒng)是大鼠肝S9和輔助因子的混合物，大鼠肝S9在培養(yǎng)基中的終濃度為0.75%（V/V），臨用前新鮮配制并保存在濕冰上。

Tab.1 Test article information and concentration selection

1.3 體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法的建立

1.3.1 細(xì)胞處理

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的TK6細(xì)胞，按3×108L-1密度接種在U型底96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)約為6×104。未加 S9（-S9）組加入終濃度為 0.2，0.4，0.8和1.6 mg·L-1的依托泊苷或0.0063，0.0125，0.025和0.05 mg·L-1的秋水仙素含藥培養(yǎng)基，處理24 h；加入S9（+S9）組加入含0.75% S9及終濃度分別為3.75，7.5，15和30 mg·L-1的環(huán)磷酰胺培養(yǎng)基處理4 h；隨后更換為不含藥完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；隨后進(jìn)行下一步處理。每濃度設(shè)2復(fù)孔。

1.3.2 細(xì)胞收獲、固定和洗滌

將含待收獲細(xì)胞的96孔板離心，用200 μL PBS洗滌2次后離心（200×g，6 min）棄上清，緩慢加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇重懸，-20℃固定過(guò)夜（約16 h，至少4 h）。固定后離心（400×g，6 min），每孔使用約200 μL PBS洗滌細(xì)胞2次，離心（400×g，6 min）棄上清。

1.3.3 抗體標(biāo)記

每孔加入60 μL PBS重懸細(xì)胞，該板標(biāo)記為板1。每孔移取20 μL細(xì)胞懸液至新的96孔板中，標(biāo)記為板2。板1每孔加入50 μL的含F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗人活化PARP抗體、PE標(biāo)記小鼠抗人P53抗體和Alexa Fluor?647標(biāo)記小鼠抗人H2AX（pS139）抗體的PST溶液。板2中每孔加入50 μL含有pS28抗體的PST溶液。將板1和板2混勻后置于室溫、避光條件下孵育1 h。標(biāo)記結(jié)束時(shí)，每孔使用PBS洗滌1次并加入200 μL PBS溶液（含有7-AAD染液0.5 mg·L-1、RNA酶A 0.5 mg·L-1和計(jì)數(shù)微珠約1×108L-1）。室溫條件下孵育10 min。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

孵育結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞凋亡。用溶劑對(duì)照孔建立和調(diào)試模板，設(shè)置γ-H2AX（圖1）和p-H3（圖2）檢測(cè)模板邏輯關(guān)系圖，去除粘連細(xì)胞和壞死細(xì)胞，分析細(xì)胞的γ-H2AX熒光強(qiáng)度和P53蛋白熒光強(qiáng)度以及p-H3陽(yáng)性細(xì)胞和凋亡細(xì)胞率。通過(guò)細(xì)胞和微珠計(jì)數(shù)比計(jì)算細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)-對(duì)照組細(xì)胞數(shù)）/微珠數(shù)×100%。

Fig.1 γ-H2AX，P53 protein expression and cell cycle detection templates.A：FL2-H vs SSC-A scatter diagram，set counting beads；B：FSC-A vs SSC-A scatter plot，set the cell gate；C：FSC-A vs FSC-H scatter plot，select single cells；D：SSC-A vs SSC-H scatter plot，select single cells；E：FL3-A channel（nucleic acid dye 7-AAD）fluorescence histogram，labling the necrotic cell peak（SUB-G1）；F：FL3-A vs FL1-A scatter plot，gate of cleaved-PARP positive cells,namely apoptotic cells；G：FL2-A channel fluorescence histogram，P53 protein fluorescence intensity gate；H：FL4-A channel fluorescence histogram，γ-H2AX fluorescence intensity gate.

Fig.2 p-H3 detection templates.A：FSC-A vs SSC-A scatter diagram，set counting beads and cells gate；B：FSC-A vs FSC-H scatter plot，to select single cell；C：SSC-A vs SSC-H scatter plot，to select single cell；D：FL3-A channel（nucleic acid dye 7-AAD）fluorescence histogram，labelling the necrotic cell peak（SUB-G1）；E：FL4-A vs FL3-A scatter plot，namely p-H3 positive cells gate.

1.4 體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法的驗(yàn)證

選擇4種不同作用機(jī)制的DNA斷裂劑（+S9條件下，絲裂霉素 C 0.05，0.1和0.2 mg·L-1，甲磺酸甲酯 3，6和12 mg·L-1，苯并芘 0.5，1，2 mg·L-1，順鉑2.5，5和10 mg·L-1；-S9條件下，絲裂霉素 C 0.025，0.05和0.1 mg·L-1，甲磺酸甲酯 1.5，3，6 mg·L-1，苯并芘 25，50和100 mg·L-1，順鉑 1.25，2.5和5 mg·L-1）、2種非整倍體誘導(dǎo)劑（+S9條件下，長(zhǎng)春新堿0.005，0.01和0.02 mg·L-1，紫杉醇 0.02，0.04和0.08 mg·L-1；-S9條件下，長(zhǎng)春新堿0.01，0.02和0.04 mg·L-1，紫杉醇0.005，0.01和0.02 mg·L-1）和3種不具有遺傳毒性的化合物（+/-S9條件下，氯化鈉 125，250和500 mg·L-1，氨芐青霉素 G 125，250和500 mg·L-1，鹽酸普萘洛爾 15，30和60 mg·L-1），以依托泊苷、秋水仙素和環(huán)磷酰胺作為陽(yáng)性對(duì)照品作用于TK6細(xì)胞，按1.3進(jìn)行細(xì)胞處理、收獲、固定、洗滌、抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。每個(gè)受試物按1∶1（V∶V）比例稀釋，共配制3個(gè)濃度，每濃度設(shè)2復(fù)孔。每個(gè)受試物最高濃度選擇見(jiàn)表1。

1.5 結(jié)果判定

受試物的作用機(jī)制依據(jù)各生物標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷（表2）。γ-H2AX和P53蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度平均值及p-H3陽(yáng)性細(xì)胞的百分比為溶劑對(duì)照組的2倍以上，則該指標(biāo)為陽(yáng)性。如受試物可引起γ-H2AX和P53蛋白陽(yáng)性熒光表達(dá)升高，p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例不升高，則該受試物為DNA斷裂劑；如果受試物可引起p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高，而γ-H2AX表達(dá)無(wú)明顯變化，無(wú)論P(yáng)53蛋白表達(dá)是否為陽(yáng)性，該物質(zhì)被判斷為非整倍體誘導(dǎo)劑；如果受試物既不能引起γ-H2AX和P53蛋白表達(dá)陽(yáng)性升高，也不能引起p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高，則該物質(zhì)可能是除DNA斷裂劑及非整倍體誘導(dǎo)劑外的其他遺傳毒性物質(zhì)或不具有遺傳毒性的化合物，需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

Tab.2 Evaluation criteria for biomarker test results

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)使用BD Accuri C6TM（1.0.264.21版）導(dǎo)出。γ-H2AX和P53蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度值和p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例的平均值均以倍數(shù)x±s表示。當(dāng)平均熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法建立

2.1.1 γ-H2AX、MP53蛋白表達(dá)和p-H3陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)

圖3A～C結(jié)果顯示，依托泊苷0.8和1.6 mg·L-1（-S9）組和環(huán)磷酰胺 30 mg·L-1（+S9）組，誘導(dǎo)γ-H2AX表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組2倍，判定為陽(yáng)性；與對(duì)照組相比，秋水仙素（-S9）各濃度組誘導(dǎo)γ-H2AX表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度比值均低于2，判定為陰性。依托泊苷0.4，0.8和1.6 mg·L-1（-S9）組和環(huán)磷酰胺30 mg·L-1（+S9）組，誘導(dǎo)P53蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度的比值高于對(duì)照組2倍，判定為陽(yáng)性；秋水仙素0.025，0.05 mg·L-1（-S9）組P53蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度高于2倍，判定為陽(yáng)性。p-H3陽(yáng)性細(xì)胞的百分比結(jié)果（圖3D）顯示，與溶劑對(duì)照組相比，依托泊苷（-S9）各組和環(huán)磷酰胺（+S9）各組p-H3陽(yáng)性細(xì)胞的百分比隨劑量增加而逐漸降低，秋水仙素（-S9）0.0125，0.025和0.05 mg·L-1誘導(dǎo)p-H3陽(yáng)性細(xì)胞的百分比值增加（P＜0.01）。

Fig.3 Genotoxicity detection of ETO（A），CP（B）and COL（C）.Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells（D）treated with ETO，CP or COL for 4 or 24 h with（+S9）or without S9（-S9）.Low，mid，sub-high and high represent the concentration of each substance：ETO 24 h(-S9)：0.2，0.4，0.8 and 1.6 mg·L-1；CP 4 h(+S9)：3.75，7.5，15 and 30 mg·L-1；COL 24 h(-S9)：0.0063，0.0125，0.025 and 0.05 mg·L-1.x±s，n=3.＊：positive result.

2.1.2 依托泊苷、環(huán)磷酰胺和秋水仙素遺傳毒性的判定

基于秋水仙素的γ-H2AX陰性，P53陽(yáng)性，p-H3為陽(yáng)性，因此可以判定秋水仙素為非整倍體誘導(dǎo)劑。依托泊苷和環(huán)磷酰胺可引起γ-H2AX和P53蛋白陽(yáng)性熒光表達(dá)升高，p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例不升高，因此可以判定依托泊苷和環(huán)磷酰胺為DNA斷裂劑。依據(jù)方法建立試驗(yàn)的結(jié)果，選擇依托泊苷1.6 mg·L-1和秋水仙素0.01 mg·L-1作為驗(yàn)證階段的-S9組的陽(yáng)性對(duì)照，環(huán)磷酰胺30 mg·L-1作為+S9組的陽(yáng)性對(duì)照。

2.2 體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法驗(yàn)證

2.2.1 絲裂霉素C、甲磺酸甲酯和卡鉑多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法驗(yàn)證

絲裂霉素C（圖4）在+/-S9處理?xiàng)l件下可誘導(dǎo)TK6細(xì)胞γ-H2AX熒光強(qiáng)度及P53陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組相比出現(xiàn)濃度相關(guān)性升高，p-H3無(wú)明顯變化。甲磺酸甲酯（圖5）在+/-S9處理?xiàng)l件下可誘導(dǎo)TK6細(xì)胞γ-H2AX熒光升高，P53蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度隨著濃度先升高后降低，p-H3無(wú)明顯變化。順鉑（圖6）在+/-S9處理?xiàng)l件下可誘導(dǎo)TK6細(xì)胞γ-H2AX熒光強(qiáng)度及P53陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組相比出現(xiàn)濃度相關(guān)性升高，p-H3無(wú)明顯變化。苯并芘（圖7）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P53蛋白平均熒光強(qiáng)度和p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例在+/-S9各劑量組并未出現(xiàn)明顯變化，γ-H2AX平均熒光強(qiáng)度在100 μmg·L-1組出現(xiàn)顯著性陽(yáng)性升高（高于對(duì)照組2倍）。根據(jù)以上結(jié)果可判定絲裂霉素C、甲磺酸甲酯、順鉑和苯并芘為斷裂劑，且苯并芘需經(jīng)S9體外代謝活化才具有DNA作用活性。

Fig.4 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells（C）treated with MMC（A）and with（B）or without（C）S9，alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.5 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with MMS（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.6 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with cDDP（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.7 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with B［a］P（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

2.2.2 紫杉醇和長(zhǎng)春新堿多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法驗(yàn)證

紫杉醇（圖8）在+/-S9條件下各劑量組γ-H2AX熒光強(qiáng)度均無(wú)劑量依賴性升高，p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例和P53蛋白熒光強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照組升高并呈現(xiàn)明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。長(zhǎng)春新堿（圖9）在+/-S9條件下各劑量組γ-H2AX熒光強(qiáng)度均無(wú)劑量依賴性升高，p-H3陽(yáng)性細(xì)胞比例與對(duì)照組相比出現(xiàn)濃度相關(guān)性升高，P53蛋白熒光強(qiáng)度在0.02 mg·L-1組出現(xiàn)顯著性陽(yáng)性升高（高于對(duì)照組2倍）。根據(jù)該結(jié)果可判定紫杉醇和長(zhǎng)春新堿為非整倍體誘導(dǎo)劑。

Fig.8 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with PT（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.9 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with VCR（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

2.2.3 氯化鈉、氨芐青霉素G和鹽酸普萘洛爾多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法驗(yàn)證結(jié)果

氨芐青霉素G（圖10）、氯化鈉（圖11）和鹽酸普萘洛爾（圖12）組在+S9和-S9的條件下，所有受試濃度誘導(dǎo)γ-H2AX和P53蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度及p-H3化的陽(yáng)性細(xì)胞比例與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)濃度依賴性陽(yáng)性升高。提示氯化鈉、氨芐青霉素G和鹽酸普萘洛爾為DNA致斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑以外的遺傳毒性化合物或不具有遺傳毒性的化合物。

Fig.10 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with Amp G（A）and with（B）or without S9（C），alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.11 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the ratio of p-H3 positive cells treated with NaCl（A）and with（B）or without（C）S9，alongside vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

Fig.12 Average fluorescence intensity of γ-H2AX，P53 and the average ratio of p-H3 positive cells treated with Prop（A）and with（B）or without S9（C），alongside with vehicle control and positive control.x±s，n=3.＊：positive result.

3 討論

本研究首先以依托泊苷（-S9）、秋水仙素（-S9）和環(huán)磷酰胺（+S9）為遺傳毒性陽(yáng)性化合物建立了基于多色流式細(xì)胞術(shù)的體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)的檢測(cè)模板和檢測(cè)方法。該方法準(zhǔn)確判斷依托泊苷和環(huán)磷酰胺為DNA斷裂劑，秋水仙素為非整倍體誘導(dǎo)劑。隨后，使用4種斷裂劑、2種非整倍體誘導(dǎo)劑和3種不具遺傳毒性的化合物對(duì)該方法的靈敏度和特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法靈敏度高，特異性好。

在驗(yàn)證階段的遺傳毒性陽(yáng)性化合物中，絲裂霉素C、甲磺酸甲酯、順鉑和苯并芘均為已知的斷裂劑，其中苯并芘的作用強(qiáng)度較弱，代謝活化后產(chǎn)生遺傳毒性。本方法可準(zhǔn)確判斷絲裂霉素C、甲磺酸甲酯、順鉑和苯并芘為斷裂劑，且苯并芘需在+S9條件下才能反應(yīng)出較弱的作用。該結(jié)果與可評(píng)價(jià)斷裂劑的試驗(yàn)、體外微核試驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符［8］。P53蛋白是間接反映DNA損傷修復(fù)的生物標(biāo)志物。在本研究中，絲裂霉素C、甲磺酸甲酯、順鉑和苯并芘均可誘導(dǎo)P53蛋白出現(xiàn)濃度依賴性升高。其中，甲磺酸甲酯誘導(dǎo)P53蛋白先升高，后降低，其原因可能為甲磺酸甲酯0.2 mg·L-1細(xì)胞毒性較強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞DNA受損嚴(yán)重，細(xì)胞壞死凋亡。壞死和凋亡的細(xì)胞也存在P53蛋白的表達(dá)。而本實(shí)驗(yàn)中，壞死和凋亡的細(xì)胞被排除計(jì)數(shù)，因此導(dǎo)致0.2 mg·L-1濃度時(shí)P53蛋白表達(dá)檢測(cè)值降低［10］。

長(zhǎng)春新堿和紫杉醇是經(jīng)典的多倍體誘導(dǎo)劑，其作用機(jī)制是：①在細(xì)胞進(jìn)行分裂時(shí)，使染色體的著絲點(diǎn)延遲分裂而形成多倍體；②誘導(dǎo)分裂中期的紡錘絲斷裂，或抑制紡錘體的形成，使得分裂后期染色體不能移向兩極而導(dǎo)致細(xì)胞停留在分裂中期［11］。本研究中，在+S9或-S9條件下，長(zhǎng)春新堿和紫杉醇誘導(dǎo)TK6細(xì)胞產(chǎn)生的p-H3的陽(yáng)性細(xì)胞比例相對(duì)于溶劑對(duì)照組均有陽(yáng)性結(jié)果，且呈現(xiàn)出濃度-效應(yīng)關(guān)系，可判定為非整倍體誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符［12］。同時(shí)，長(zhǎng)春新堿和紫杉醇均不能誘導(dǎo)γ-H2AX表達(dá)升高。但紫杉醇可以誘導(dǎo)P53蛋白表達(dá)升高，最高為溶劑對(duì)照的4.5倍，而長(zhǎng)春新堿卻未誘導(dǎo)P53蛋白表達(dá)升高。此結(jié)果提示，長(zhǎng)春新堿和紫杉醇作用于紡錘體的機(jī)制可能不完全相同，具體原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

氯化鈉、氨芐青霉素G和鹽酸普萘洛爾是已知的不具有遺傳毒性的化合物。本研究中，氯化鈉、氨芐青霉素G最高濃度設(shè)為500 mg·L-1，為ICH遺傳毒性指導(dǎo)原則S2（R1）對(duì)于無(wú)毒性化合物所推薦的最高濃度［12］。在+S9或-S9條件下，3種物質(zhì)誘導(dǎo)TK6細(xì)胞的γ-H2AX和P53蛋白表達(dá)相對(duì)于溶劑對(duì)照組無(wú)明顯變化，誘導(dǎo)P-H3細(xì)胞比例與溶劑對(duì)照組相比也無(wú)陽(yáng)性升高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，以上3種物質(zhì)未在體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法中檢測(cè)出遺傳毒性，與已發(fā)表文獻(xiàn)中的結(jié)果一致［14］。

細(xì)胞核與計(jì)數(shù)微珠比率（核珠比）評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的結(jié)果顯示，在+S9條件下，長(zhǎng)春新堿、甲磺酸甲酯和苯并芘最高濃度的細(xì)胞毒性接近60%。在-S9條件下，紫杉醇、甲磺酸甲酯和順鉑在最高濃度的細(xì)胞毒性接近或超過(guò)60%。提示以核珠比計(jì)算得到的細(xì)胞毒性作為最高濃度選擇依據(jù)時(shí)，比細(xì)胞計(jì)數(shù)法更為嚴(yán)格。

本研究還發(fā)現(xiàn)，由受試物引起的細(xì)胞凋亡，可以產(chǎn)生較大的γ-H2AX熒光強(qiáng)度波動(dòng)。且由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以發(fā)現(xiàn)，遺傳毒性物質(zhì)中細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例與γ-H2AX熒光強(qiáng)度增加趨勢(shì)相近，提示細(xì)胞凋亡可能會(huì)影響DNA雙鏈斷裂導(dǎo)致的γ-H2AX升高。本研究選擇活化PARP作為細(xì)胞凋亡生物標(biāo)志物，在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，通過(guò)門策略排除細(xì)胞凋亡過(guò)程激活胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3表達(dá)而產(chǎn)生的γ-H2AX［15］，可降低該法的假陽(yáng)性。

本研究初步建立了基于多色流式細(xì)胞術(shù)的體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法。該方法使用p53基因完整的TK6細(xì)胞，同時(shí)引入核珠比計(jì)算細(xì)胞毒性，使用多終點(diǎn)生物標(biāo)志物檢測(cè)遺傳毒性，單次試驗(yàn)即可獲得多種化合物作用機(jī)制信息。流式細(xì)胞術(shù)分析方法和96孔板培養(yǎng)體系使該法可實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)，平均48 h即可獲得測(cè)量結(jié)果。但是目前該實(shí)驗(yàn)方法尚缺乏廣泛的試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持和標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程，因此將該法用于化合物遺傳毒性評(píng)價(jià)前仍需大量的試驗(yàn)研究。

綜上所述，基于多色流式細(xì)胞術(shù)的體外多終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法在檢測(cè)化合物遺傳毒理機(jī)制方面具有快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)，在進(jìn)行遺傳毒理研究方面有巨大潛力，未來(lái)可對(duì)藥物、環(huán)境毒物等化合物進(jìn)行高通量遺傳毒性檢測(cè)。