梁桉婕，繆小蘭，段 杉

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院// 廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心// 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642）

由于消費(fèi)習(xí)慣差異，我國(guó)消費(fèi)者對(duì)鮮羅非魚（Oreochromis）制品的接受度比凍結(jié)品更高，近年來一大批生鮮連鎖店迅速成長(zhǎng)，生鮮羅非魚產(chǎn)品的開發(fā)符合當(dāng)前形勢(shì)要求。但普通貯藏溫度（4 ℃）下羅非魚保質(zhì)期短，不適合生鮮銷售；而冰溫貯藏（Controlled Freezing-Point Storage，溫度介于0 ℃和產(chǎn)品冰點(diǎn)之間）和微凍（Superchilled Storage，溫度略低于產(chǎn)品冰點(diǎn)）可大大延長(zhǎng)保質(zhì)期[1]，適應(yīng)生鮮銷售要求。

冰溫和微凍貯藏的溫度已接近或超過多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的冰點(diǎn)，寒冷脅迫將導(dǎo)致細(xì)菌群落組成以及代謝活動(dòng)發(fā)生顯著變化。較普通貯藏條件下，能適應(yīng)這種低溫的細(xì)菌種類更少，本課題組[2]前期研究發(fā)現(xiàn)在0 和-3 ℃貯藏條件下的羅非魚片與4 ℃的樣品相比，細(xì)菌種類顯著變少，腐敗速度顯著降低。

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)（GB2733-2015）》中除了感官評(píng)價(jià)外，僅以TVB-N值作為評(píng)價(jià)淡水魚鮮度的客觀指標(biāo)，但有研究認(rèn)為TVB-N 值不適于衡量冰溫和微凍貯藏條件下羅非魚鮮度[3-7]，而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于冰溫和微凍貯藏條件下羅非魚及其他水產(chǎn)品的腐敗標(biāo)志物的研究報(bào)道極少。因此，本研究通過測(cè)定4 ℃（普通貯藏）和-1.5 ℃（冰溫及微凍貯藏）條件下羅非魚的TVB-N值、菌落總數(shù)以及感官鮮度的變化，并采用電子鼻追蹤揮發(fā)性成分的變化，探究羅非魚的感官腐敗程度與TVB-N 值和其他揮發(fā)性成分之間的相關(guān)性進(jìn)行比較研究，分析兩種貯藏溫度下的腐敗產(chǎn)物差異，查找羅非魚在冰溫和微凍貯藏條件下潛在的腐敗標(biāo)志物，以期為客觀衡量相關(guān)羅非魚制品的鮮度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚（600～ 800 g）購(gòu)于廣州市長(zhǎng)湴農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。長(zhǎng)虹美菱BCD-255WP3CX 冰箱；德國(guó)Airsense公司PEN3 電子鼻。

1.2 方法

1.2.1羅非魚前處理 6 尾羅非魚均購(gòu)自同一市場(chǎng)。將新鮮羅非魚宰殺、去頭、去皮、去內(nèi)臟，用自來水清洗干凈，取肉切成小塊，采用無(wú)菌保鮮盒包裝。取3 尾置于（4±0.6）℃冰箱貯藏，0、1、2、3、4、5、6、7 d 分別采樣檢測(cè)；另外3 尾置于（-1.5±0.8）℃冰箱冰溫貯藏，0、6、12、18、21、24 d采樣檢測(cè)。

1.2.2感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)小組由固定經(jīng)過培訓(xùn)的5 人組成，采用打分和描述相結(jié)合的方法，分別針對(duì)羅非魚的氣味、色澤、質(zhì)地打分，很新鮮0 分，新鮮1 分，一般2 分，略有腐敗3 分，明顯腐敗4分，完全不可接受5 分；并對(duì)腐敗特征進(jìn)行描述，氣味特征描述包括正常香味、鮮香、硫化氫味道、氨味、酸味以及腥臭味，色澤外觀描述包括發(fā)暗、發(fā)紅、光澤以及有無(wú)黏液，質(zhì)地描述包括軟爛程度、彈性、組織緊密程度以及紋理清晰程度。最后計(jì)算平均分。

1.2.3揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測(cè)定 按照GB/T 5009.44—2003[8]微量擴(kuò)散法，以每100 g 樣品中所含氮的質(zhì)量（mg）表示，每次測(cè)定3 個(gè)平行樣品。

1.2.4可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定 按照GB/T 4789.2—2016[9]平板計(jì)數(shù)法操作：無(wú)菌條件下剪取10 g 魚肉加入90 mL 滅菌生理鹽水，搖床120 r/min 振搖30 min。取1 mL 菌懸液梯度稀釋后采用計(jì)數(shù)培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌落數(shù)，結(jié)果取對(duì)數(shù)值。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.5揮發(fā)性成分的測(cè)定 采用電子鼻測(cè)定，稱取攪碎的羅非魚肉3.5 g，置于20 mL 進(jìn)樣瓶中，頂空平衡溫度60 ℃，平衡時(shí)間15 min。電子鼻測(cè)定條件：注射針溫度50 ℃，清洗時(shí)間100 s，進(jìn)氣量150 mL/min，測(cè)定時(shí)間120 s，特征值提取時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為19～21 s，對(duì)特征時(shí)間段內(nèi)的信息進(jìn)行分析，每個(gè)樣品均制備2 個(gè)平行樣，結(jié)果去掉異常值，以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 進(jìn)行處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并作單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同貯藏溫度下羅非魚腐敗的感官評(píng)價(jià)

由表1 可知，貯藏于4 ℃的羅非魚至6 d 時(shí)腐敗特征已很明顯，7 d 時(shí)基本不可接受；貯藏于-1.5 ℃的羅非魚至18 d 時(shí)腐敗特征已很明顯，21 d時(shí)基本不可接受，Cyprian 等[1]報(bào)道羅非魚于-1 ℃貯藏20 d 后發(fā)生感官腐敗，Laly 等[4]報(bào)道去內(nèi)臟的羅非魚在冰藏21 d 后發(fā)生感官腐敗，本研究結(jié)果與上述結(jié)果很接近。

表1 貯藏于4 ℃和-1.5 ℃的羅非魚感官評(píng)價(jià)分值Table 1 Sensory scores of tilapia respectively stored at 4 ℃ and -1.5 ℃

2.2 不同貯藏溫度下羅非魚的TVB-N 值和細(xì)菌總數(shù)的變化

從圖1 可以看出，4 ℃貯藏的羅非魚的TVB-N值在0～ 6 d 變化較小，貯藏7 d 后迅速升高；而-1.5 ℃貯藏的羅非魚的TVB-N 值在0～ 21 d 變化較小，貯藏24 d 后迅速升高。但無(wú)論是4 ℃還是-1.5 ℃貯藏的羅非魚，至感官評(píng)價(jià)發(fā)生腐敗時(shí)（分別為6 d 和21 d）其TVB-N 值仍未超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的限量規(guī)定（20 mg/100 g），此結(jié)果與Parlapani 等[3]、Laly 等[4]和S?rensena 等[7]的研究結(jié)果一致。菌落總數(shù)一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，4 ℃貯藏羅非魚的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)較快，貯藏3 d 后已超過107cfu/g，5 d已達(dá)到109cfu/g；而-1.5 ℃貯藏羅非魚菌落總數(shù)在貯藏6 d 后仍低于106cfu/g，15 d 才達(dá)到109cfu/g。上述結(jié)果與本課題組前期研究[2]以及Cyprian 等[1]、Laly 等[4]的報(bào)道相近。

-1.5 ℃貯藏下TVB-N 值及菌落總數(shù)的增長(zhǎng)速度約為4 ℃下的3 倍，這與冰點(diǎn)溫度附近對(duì)細(xì)菌的寒冷脅迫作用顯著增強(qiáng)有很大關(guān)系。在細(xì)胞冰點(diǎn)溫度附近，細(xì)菌會(huì)遭受諸如活性氧自由基濃度升高、膜流動(dòng)性和酶活性下降、胞內(nèi)水分結(jié)冰、蛋白質(zhì)低溫變性等傷害[10]，其對(duì)細(xì)菌生命活動(dòng)的抑制作用是多方面的，與常溫或普通貯藏溫度下溫度降低導(dǎo)致代謝速度下降的效應(yīng)不能等同，因此-1.5 ℃與4 ℃相比，細(xì)菌的生長(zhǎng)和腐敗特征差異巨大。

此外，從圖1 還可以發(fā)現(xiàn)TVB-N 值與菌落總數(shù)的增長(zhǎng)并不同步，無(wú)論4 ℃還是在-1.5 ℃，均直至菌落總數(shù)達(dá)到109cfu/g 左右時(shí)TVB-N 才快速增長(zhǎng)，這與細(xì)菌的群體感應(yīng)有關(guān)，即菌落總數(shù)比較少的時(shí)候，細(xì)菌的腐敗分解作用很弱，當(dāng)數(shù)量增長(zhǎng)到一定程度后細(xì)胞之間通過群體感應(yīng)作用才表現(xiàn)出強(qiáng)烈的腐敗作用[11]。

圖1 貯藏于4 ℃和-1.5 ℃的羅非魚的TVB-N 值和菌落總數(shù)變化Fig.1 TVB-N value and bacterial count of tilapia respectively stored at 4 ℃ and -1.5 ℃

2.3 不同貯藏溫度下羅非魚揮發(fā)性成分的變化

由圖2 可見，貯藏于4 ℃和-1.5 ℃的羅非魚的揮發(fā)性成分差異很大，其中差異最明顯的是氮氧化合物，貯藏于-1.5 ℃的羅非魚的氮氧化合物含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，至腐敗時(shí)含量遠(yuǎn)高于貯藏于4 ℃的羅非魚；貯藏于-1.5 ℃的羅非魚的甲基類化合物、無(wú)機(jī)硫化物、有機(jī)硫化物也隨時(shí)間逐漸上升，且無(wú)論是含量還是變化趨勢(shì)均與貯藏于4 ℃的羅非魚有一定差異；貯藏于-1.5 ℃的羅非魚的醇類和醛酮類化合物的變化則規(guī)律性較差。這是因?yàn)? ℃貯藏羅非魚細(xì)菌群落與冰溫貯藏羅非魚細(xì)菌群落的組成有明顯差異[2]，此外，寒冷脅迫也導(dǎo)致細(xì)菌代謝活動(dòng)發(fā)生顯著變化，故4 ℃貯藏和冰溫貯藏羅非魚的揮發(fā)性成分也有所不同。以上各類揮發(fā)性化合物在貯藏初期均出現(xiàn)下降，然后穩(wěn)步上升，推測(cè)這一現(xiàn)象的原因如下：0 d 為實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)，此前羅非魚一直處于室溫，溫度遠(yuǎn)高于4 ℃和-1.5 ℃，細(xì)菌代謝活動(dòng)遠(yuǎn)比實(shí)驗(yàn)溫度下強(qiáng)，產(chǎn)生的揮發(fā)性產(chǎn)物更多；實(shí)驗(yàn)開始后，羅非魚肉中心溫度大大降低，細(xì)菌代謝活動(dòng)迅速降低，腐敗產(chǎn)物的生成速度大幅下降；而且實(shí)驗(yàn)開始前細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性成分大量揮發(fā)，新生成的揮發(fā)性成分暫時(shí)無(wú)法彌補(bǔ)揮發(fā)的損失，導(dǎo)致貯藏初期揮發(fā)性成分含量下降，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)菌大量增殖，產(chǎn)生的揮發(fā)性成分也穩(wěn)步上升。

圖2 不同貯藏溫度下羅非魚揮發(fā)性成分變化Fig.2 Volatile organic compounds of tilapia respectively stored at 4 ℃ and -1.5 ℃

2.4 不同貯藏溫度下羅非魚的TVB-N 值、菌落總數(shù)、揮發(fā)性成分及感官評(píng)價(jià)間的相關(guān)性分析

對(duì)TVB-N 值、菌落總數(shù)、揮發(fā)性成分以及感官評(píng)價(jià)的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。從表2 可發(fā)現(xiàn)，TVB-N 值與4 ℃貯藏羅非魚的感官腐敗評(píng)分顯著相關(guān)（P＜ 0.05），但與-1.5 ℃貯藏羅非魚的感官腐敗評(píng)分相關(guān)不顯著（P＞ 0.05），說明TVB-N 值并不能準(zhǔn)確反映冰溫和微凍貯藏羅非魚的限度變化，這一結(jié)果與其他研究[3-7]的結(jié)果一致；此外，TVB-N 值與細(xì)菌數(shù)量之間的相關(guān)性也較低。

表2 TVB-N 值、菌落總數(shù)、揮發(fā)性成分與感官評(píng)價(jià)結(jié)果間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficients between TVB-N,bacterial counts,volatile organic compounds and sensory evaluation results

Parlapani 等[3]認(rèn)為TVB-N 值僅適合于評(píng)價(jià)貯藏于較高溫度下的魚類鮮度，這可能因?yàn)榕c普通貯藏相比，-1.5 ℃貯藏魚類的細(xì)菌群落及其代謝特征已發(fā)生明顯變化，導(dǎo)致腐敗產(chǎn)物不同；此外，貯藏或凍藏的魚類的內(nèi)源酶活動(dòng)仍可導(dǎo)致TVB-N 值增加[12]，-1.5 ℃的低溫對(duì)于細(xì)菌活動(dòng)有顯著抑制作用，但對(duì)生化反應(yīng)速度的影響相對(duì)較小，因此，-1.5 ℃時(shí)魚體內(nèi)源酶活動(dòng)產(chǎn)生的TVB-N 值占比大幅提高，與細(xì)菌性腐敗的相關(guān)性下降。

4 ℃貯藏條件下，菌落總數(shù)與感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)呈極顯著相關(guān)（P＜ 0.01），但與各揮發(fā)性成分間的相關(guān)性較低。-1.5 ℃冰溫條件下，細(xì)菌總數(shù)與感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)、甲基類化合物均呈顯著相關(guān)（P＜ 0.05）,甲基類化合物與氣味、色澤評(píng)分呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。這一結(jié)果顯示菌落總數(shù)仍可表征4 ℃和-1.5 ℃溫度下貯藏羅非魚的鮮度，甲基類成分具有作為冰溫或微凍貯藏羅非魚腐敗標(biāo)志物的潛力，但本研究所用樣本量有限，是對(duì)冰溫或微凍貯藏羅非魚腐敗標(biāo)志物的初步篩選，后續(xù)需要通過增加樣本量以及改變實(shí)驗(yàn)條件以進(jìn)一步研究確認(rèn)。

3 結(jié)論

4 ℃時(shí)，TVB-N 值與感官評(píng)價(jià)結(jié)果的相關(guān)性較高，適合作為羅非魚的鮮度評(píng)價(jià)指標(biāo)；但在-1.5 ℃時(shí)，TVBN 值與感官評(píng)價(jià)結(jié)果的相關(guān)性不高，說明在該溫度附近TVB-N 值不適于作為羅非魚的鮮度指標(biāo)。貯藏于4 ℃和-1.5 ℃的羅非魚的揮發(fā)性成分也相差很大，-1.5 ℃的羅非魚的氮氧化合物含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，至腐敗時(shí)含量遠(yuǎn)高于貯藏于4 ℃的羅非魚，其他揮發(fā)性成分也有顯著差異。貯藏于-1.5 ℃的羅非魚腐敗氣味感官評(píng)分與氮氧化物、無(wú)機(jī)硫化物、有機(jī)硫化物含量的相關(guān)性良好，而與甲基類成分呈顯著相關(guān)。顯示甲基類成分具有作為冰溫貯藏羅非魚腐敗標(biāo)志物的潛力。