丁振山，周曉峰，馬潞林

（1.北京大學第三醫(yī)院 泌尿外科，北京 100191；2.中日友好醫(yī)院 泌尿外科，北京 100029）

腎癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一，占成年人所有惡性腫瘤的2%～3%[1]。根據(jù)腫瘤組織細胞的形態(tài)學特點，結(jié)合基因改變和腫瘤的起源可將腎細胞癌分為多種亞型。其中，乳頭狀腎細胞癌（papillary renal cell carcinoma，PRCC）是僅次于透明細胞癌的第二大腎細胞癌亞型，占全部腎細胞癌15%～20%[2]。根據(jù)細胞及結(jié)構(gòu)特征，將PRCC 分為1 型和2 型。一般認為2 型的惡性程度顯著高于1 型。進展期腎癌的生物學特點之一為靜脈系統(tǒng)受到累及，其發(fā)生率約4%～10%[3]。靜脈系統(tǒng)受累的2 型PRCC 患者預(yù)后更差，其5年腫瘤特異性生存率僅為57.4%[4]。但關(guān)于腎癌靜脈瘤栓形成的機制目前尚未清楚，研究顯示，瘤栓的形成與BRCA 的 基 因 突 變[5]、PD-L1表達缺失[6]等有關(guān)。miRNA 是一類長約20 個核苷酸的RNA，主要在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達，廣泛參與正常及異常的生物學過程，并在腎癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[7]?，F(xiàn)階段對于miRNA 在2 型PRCC 下腔靜脈瘤栓形成中的作用尚不明確，本研究著重探討miR-199b-5p 在2 型PRCC 合并下腔靜脈瘤栓中的表達及功能。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本及資料

納入2012年1月～2018年3月在北京大學第三醫(yī)院及中日友好醫(yī)院泌尿外科住院治療的2型PRCC 合并及不合并下腔靜脈瘤栓患者組織樣本各22 份，44 例患者均經(jīng)術(shù)前CT 和術(shù)后病理證實，診斷標準符合2014 版歐洲泌尿外科腎癌診治指南標準。其中男38 例、女6 例；年齡45～84 歲，中位年齡66 歲。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究獲得北京大學第三醫(yī)院及中日友好醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 miRNA 芯片、細胞和主要試劑

miRNA 芯 片 為Agilent Human miRNA，Release 21.0（8×60K，Design ID：070156）。人腎癌細胞系CAKI-2 和CAL-54 細胞分別從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）和德國DSMZ 獲得。CAKI-2 培育在含10%胚牛血清（FBS）的McCoy's 5A 培養(yǎng)基，CAL-54 在含有15%FBS、0.4μg/ml 氫化可的松和10ng/ml EGF 的DMEM 細胞培養(yǎng)基中生長。細胞培養(yǎng)基和胚牛血清購自Gibco 公司；TRIzol 試 劑 購 自Invitrogen 公 司；RT-qPCR 引 物由北京天一輝遠生物公司合成；CCK8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。miR-199b-5p過表達質(zhì)粒（miR-199b-5p-up）及陰性對照質(zhì)粒（NC）均為上海吉凱生物公司產(chǎn)品。瞬轉(zhuǎn)試劑使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher，11668030）。逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR 試劑盒為北京全金式生物公司產(chǎn)品。

1.3 主要實驗方法

細胞系選擇： 基于PRCC 癌細胞性狀的文獻證據(jù)及基因表達特性，選擇了CAKI-2 和CAL-54細胞作為2 型PRCC 最適合的細胞系[8]。細胞培養(yǎng)技術(shù)遵循常規(guī)細胞培養(yǎng)技術(shù)方法，瞬轉(zhuǎn)操作按照Lipo2000 說明書操作。

CCK-8 檢測細胞增殖能力：取對數(shù)生長期的CAKI-2、CAL-54 分別轉(zhuǎn)染miR-199b-5p-up 和NC 后，接種于96 孔板，每孔接種1×103個細胞，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h、120h，分別在每組各孔加入10μl CCK-8 溶液，37℃孵育3h 后于酶標儀450nm 處測量吸光度。

細胞侵襲實驗： 使用Matrigel 基質(zhì)膠與PBS緩沖液按1：8 比例配置Transwell 小室基質(zhì)膜。消化、離心、計數(shù)細胞后，按照2×104/ml 用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞制備成CAKI-2、CAL-54 細胞懸液。按照每孔200μl，將細胞懸液加入Transwell 上室，下室加入完全培養(yǎng)基500μl，37℃孵箱培養(yǎng)24h 后，使用75%乙醇及1%結(jié)晶紫溶液固定和染色，晾干后拍照計數(shù)。

RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄、qPCR：使用TRIzol 試劑提取組織和細胞中的總RNA，按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR 采用SYBR Green I 熒光染料法完成。miR-199b-5p 正向引物為5’-CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC-3’，反向引物為通用引物；細胞增殖抗原（Ki67）正向引物為5’-AGAAGAAGTGGTGCTTCGGAA-3’，反向引物為5’-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3’；基質(zhì)金屬蛋白酶2 （MMP2） 正向引物為5’-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT -3’，反向引物為 5’ -CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3’。采用GAPDH作為內(nèi)參，正向引物為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，反向引物為5’-CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT-3’。通過2-△△Ct 計算RNA 相對表達量。所有實驗均獨立重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。2 組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-199b-5p 在腎癌合并下腔靜脈瘤栓癌組織中表達下調(diào)

miRNA 芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在2 型PRCC 合并下腔靜脈瘤栓癌10 例患者的組織中相對于配對的不合并下腔靜脈瘤栓的癌組織中，包括miR-199b-5p、miR-218-5p、miR-96-5p 等63 條在內(nèi)的miRNA 下調(diào)； 包括miR-7155-3p、miR-4685-5p 等的154 條miRNA 上調(diào)（圖1A，見封二）。使用RT-qPCR 在22 對樣本中對差異表達的候選基因進行擴大樣本驗證，發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p 在腎癌合并下腔靜脈瘤栓中表達顯著下調(diào) （P＜0.05）（圖1B，見封二）。

圖1 合并及不合并瘤栓患者癌組織中差異表達miRNA篩選。A.miRNA在合并及不合并下腔靜脈瘤栓患者組織中差異表達。B.miR-199b-5p在合并下腔靜脈瘤栓癌組織中表達顯著下調(diào)（P ＜0.05）。

2.2 過表達miR-199b-5p 抑制腎癌細胞增殖、克隆形成、侵襲能力

為了驗證miR-199b-5p 生物學功能，使用CCK-8 法檢測過表達miR-199b-5p 對于CAKI-2和CAL-54 細胞增殖影響。與NC 組相比，miR-199b-5p-up 組的CAKI-2 和CAL-54 細胞增殖活力降低，并呈時間依賴性（圖2A 和2B，見封二）。細胞侵襲實驗結(jié)果表明，與NC 組相比，miR-199b-5p-up 組的CAKI-2 和CAL-54 細胞的侵襲能力降低（P＜0.05）（圖2C 和2D，見封二）。

圖2 過表達miR-199b-5p的細胞功能學實驗。A、B.過表達miR-199b-5p可以抑制CAKI-2和CAL-54細胞增殖能力。C、D.過表達miR-199b-5p可以抑制CAKI-2和CAL-54細胞侵襲能力。

2.3 2 型PRCC 合并下腔靜脈瘤栓組織樣本中Ki67 和MMP2 表達顯著升高

圖3 示，與不合并下腔靜脈瘤栓組織相比，合并下腔靜脈瘤栓組織中Ki67 和MMP2 表達顯著升高（P＜0.05）（圖3）。

圖3 腎癌合并下腔靜脈瘤栓組織中Ki67 和MMP2 表達

2.4 過表達miR-199b-5p 后Ki67 和MMP2 表達下調(diào)

圖4 示，過表 達miR-199b-5p 后，Ki67 和MMP2 在CAKI-2 細胞中表達顯著下調(diào)（P＜0.05），而在CAL-54 細胞中無差異。

圖4 過表達miR-199b-5p 后瘤栓和MMP2 表達下調(diào)

3 討論

腎癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一，25%～30%的患者在診斷時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病[9]。腎癌Ⅰ期患者的5年生存率為95%[10]，而2 型PRCC的患者預(yù)后更差。對于合并下腔靜脈瘤栓的患者，5年總體生存率及腫瘤特異性生存率分別為41.9%及47.7%[11]。因此，明確腎癌合并瘤栓的發(fā)病機制，對于早期發(fā)現(xiàn)和治療腎癌具有重要意義。

3.1 miR-199b-5p 在2 型PRCC 合并瘤栓患者中的表達情況

本研究發(fā)現(xiàn)，與不合并下腔靜脈瘤栓的2 型PRCC 患者相比，合并瘤栓的患者癌組織中miR-199b-5p 顯著下調(diào)。通過體外細胞系中將miR-199b-5p 過表達，腎癌細胞的增殖和侵襲能力顯著降低。結(jié)果提示，miR-199b-5p 與PRCC 瘤栓的形成密切相關(guān)。相關(guān)文獻報道，miR-199b-5p 參與到多種腫瘤的生物學行為：Won 等[12]提出miR-199b-5p 通過介導(dǎo)的Notch 信號通路促進骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展；Fang 等[13]的研究表明miR-199b-5p的下調(diào)與乳腺癌侵襲性臨床特征相關(guān)，且miR-199b-5p 下調(diào)是與乳腺癌患者更差的總體生存率相關(guān)，是其獨立的不良預(yù)后因素；Wang 等[14]報道，miR-199b 低表達可能通過介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α 上調(diào)促進肝細胞癌進展并與生存率呈負相關(guān)。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，Lai 等[15]報道m(xù)iR-199b-5p 是腎透明細胞癌的一種抑癌因子，但其具體作用機制尚未闡明。此外，其異常表達也見于卵巢癌及髓母細胞瘤等其他惡性腫瘤[16，17]。

3.2 miR-199b-5p 的下調(diào)可能通過介導(dǎo)Ki67 和MMP2 表達調(diào)控下腔靜脈瘤栓的形成

對于腎癌瘤栓的形成機制，目前研究尚不充分。Gregor 等[18]通過對37 例原發(fā)性腫瘤和瘤栓組織進行全外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)瘤栓組織中的約22%的基因存在功能性突變，認為某些亞類基因的突變可能導(dǎo)致腎癌瘤栓形成。Justin 等[19]多組學生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，肝細胞核因子1β 與腎透明細胞癌的腫瘤相關(guān)瘤栓形成有關(guān)，但未探究其具體機制。有研究報道腎癌瘤栓的發(fā)生與BRCA的基因突變及PD-L1 表達缺失等有關(guān)[5，6]。本研究中，我們檢測了2 型PRCC 合并及不合并瘤栓組織中代表細胞增殖能力和侵襲能力的Ki67 和MMP2，發(fā)現(xiàn)合并下腔靜脈瘤栓組織中Ki67 和MMP2 表達顯著升高，而在腎癌細胞系中，過表達miR-199b-5p 后，細胞中瘤栓和MMP2 表達下調(diào)，提示2 型PRCC 中miR-199b-5p 下調(diào)可能通過介導(dǎo)Ki67 和MMP2 表達調(diào)控下腔靜脈瘤栓的形成。

本研究存在一些局限性。雖然研究證實表達miR-199b-5p 可以抑制2 型PRCC 細胞系增殖和侵襲能力，但具體的分子機制未予更深層次的探究，且體外培養(yǎng)細胞系尚不能代表腎癌的全部病理特征，同時亦缺少挽救實驗進行反向驗證。