馬 莉，卞美璐★，于 歡，李 茜，張慶霞，陽艷軍，賀桂芳，陳慶云，陳 曦，鄒志遠(yuǎn)，劉紅剛

（1．中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；2.廣東省HPV 工程研究開發(fā)中心，廣東惠州 516000；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 病理科，北京 100005）

宮頸癌作為一種感染性惡性腫瘤，是全球女性的第四大常見腫瘤[1]。有研究指出[2]，多達(dá)80%的女性在一生中會(huì)感染人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV），但僅有一小部分感染者進(jìn)展為惡性病變，為探討HPV 感染在宮頸癌發(fā)生過程中的作用以及癌變過程中宿主基因甲基化的情況，本研究對(duì)我院宮頸病變?cè)\療中心門診機(jī)會(huì)性篩查女性的宮頸脫落細(xì)胞學(xué)樣本中HPV 分型以及甲基化情況進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1 患者一般情況

選取2019年10月～2020年1月在中日友好醫(yī)院宮頸病變?cè)\療中心門診就診的機(jī)會(huì)性篩查女性494 例，年齡18～71 歲，平均38.6±10.2 歲；其中18～35 歲人群占比42.5%（210/494）。

入組患者主要為既往HPV 感染史、異常液基細(xì)胞學(xué)檢查（liquid-based cytologic test，LBC）診斷及Leep 術(shù)后隨訪異常者，均進(jìn)行陰道鏡檢查及活檢。包括：（1）HPV16/18 型陽性者100 例；（2）非16/18 亞型HPV 感染者伴L(zhǎng)BC≥非典型鱗狀上皮細(xì)胞意義不明確 （atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）228 例； （3）LBC≥非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC），不能除外高級(jí)別鱗狀上皮病變 （atypical squamous cell，cannot exclude high -grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H） 者53 例；（4）Leep 術(shù)后隨診發(fā)現(xiàn)LBC≥ASC-US 者113 例。所有樣本同時(shí)進(jìn)行了HPV37 分型檢測(cè)和甲基化檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPV37 分型檢測(cè)

用HPV37 分型試劑盒（hybrid bio，中國(guó)），采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）+導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測(cè)宮頸細(xì)胞標(biāo)本中37 種HPV基因型感染，高危型HPV 包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，共13 種亞型；中危型HPV 包含26、53、66、73 及82，共5 種亞型；低危型HPV 包含6、11、42、43、44、34、40、54、55、57、61、67、69、70、71、72、81、83、84，共19 種亞型。

1.2.2 甲基化檢測(cè)

1.2.2.1 DNA 分離和亞硫酸氫鹽處理

根據(jù)制造商的建議，用DNA 迷你試劑盒（hybrid bio，中國(guó)）從收集到的宮頸脫落細(xì)胞樣本中提取基因組DNA。使用NanoDrop One/One c（Thermo scientific，美國(guó)）測(cè)定DNA 濃度。DNA 產(chǎn)量為＞200ng 的樣品被考慮用于進(jìn)一步的測(cè)試。亞硫酸氫鹽處理純化基因組DNA 時(shí)，根據(jù)制造商的建議使用DNA 甲基化試劑盒（hybrid bio，中國(guó)）。

1.2.2.2 DNA 甲基化測(cè)試

利用ABI7500 PCR 系統(tǒng) （Life Technologies，Thermo Fischer Scientific，美國(guó)）擴(kuò)增taqman 為基礎(chǔ)的定量甲基化-特異性聚合酶鏈反應(yīng)（QMSP），測(cè)定SOX1 和PAX1 的甲基化水平。我們?cè)O(shè)計(jì)了Actin Beta 基因（ACTB）作為內(nèi)參，并對(duì)每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)。如果標(biāo)記ACTB 的Ct 值≤35，則認(rèn)為樣品具有足夠的質(zhì)量?？偡磻?yīng)體積25μl 包含2μl modifified 模 板DNA，23μl 定 制TaqMan 試劑。PCR 在以下條件進(jìn)行：95℃10min，95℃10s共45 個(gè)循環(huán)，60℃（根據(jù)引物集）20s。如果甲基化SOX1 的Ct 值≤38.6，或者甲基化PAX1 的Ct值≤38，則認(rèn)為整個(gè)DNA 甲基化試驗(yàn)為陽性。

1.2.3 組織病理學(xué)

組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）（2014）宮頸病變的分級(jí)系統(tǒng)[3]，所有樣本的組織病理學(xué)診斷均由2 名專業(yè)病理醫(yī)生獨(dú)立診斷分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 軟件，計(jì)數(shù)資料采用率或百分比（%）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用 字2檢驗(yàn)，理論頻數(shù)1～5 時(shí)，進(jìn)行校正或用Fisher 精確概率法。計(jì)算具有95%可信區(qū)間（CI）的比值比（OR），來評(píng)價(jià)不同因素作用下的感染風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié)果

2.1 HPV37 分型結(jié)果

對(duì)低、中、高危型HPV 共計(jì)37 種亞型進(jìn)行了檢測(cè)。494例樣本中，除了HPV26、HPV57 和HPV83 亞型未檢測(cè)到，其他34 種HPV 亞型的總感染率為63.36%（313/494）； 其中低危型HPV 總感染率為23.28%；中危型HPV 總感染率8.30%；高危型HPV 總感染率54.05%。因HPV 感染有多重感染狀態(tài)，感染率以感染頻次計(jì)算，故低、中、高危型感染計(jì)數(shù)累計(jì)高于總感染計(jì)數(shù)陽性值。

HPV 感染的狀態(tài)：HPV 單一感染率55.59%（174/313）；多重感染率是44.41%（139/313）。患者既往有HPV 感染病史者，本次HPV37 分型檢測(cè)結(jié)果與其既往HPV 分型結(jié)果相比較，如果有HPV檢測(cè)結(jié)果的改變或者HPV 感染型別的改變，視為HPV 反復(fù)陽性，其中包括HPV 轉(zhuǎn)陰性而本次結(jié)果再次陽性病例；如果既往和本次HPV 檢測(cè)結(jié)果均為陽性且HPV 型別沒有變化，視為HPV 持續(xù)陽性。本組患者HPV 反復(fù)陽性136 例，占27.5%；HPV 持續(xù)陽性247 例，占50.0%。

表1 不同組織病理學(xué)診斷的HPV 感染狀況 n（%）

表2 甲基化陽性的危險(xiǎn)因素統(tǒng)計(jì)

表3 HPV37 分型檢測(cè)和甲基化檢測(cè)的診斷效能

以組織病理學(xué)診斷進(jìn)行分組，HPV 感染情況見表1?！莞呒?jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變 （high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）HPV 感染率隨著病變程度的加重而增加，在SCC 和腺細(xì)胞癌（adenocarcinoma，AC）中感染率均為100%，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P<0.01）。以組織病理學(xué)診斷≥HSIL 為宮頸病變陽性的標(biāo)準(zhǔn)，HPV 感染顯著增加宮頸病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn) （OR=1.949，95%CI：1.321～2.875，P<0.01）。

本組患者HPV16 型感染率最高，占19.03%（94/494）：?jiǎn)我桓腥?2 例、占55.32%（52/94）；多重感染42 例、占44.68%（42/94）。HPV16 型感染是甲基化陽性、HSIL 和SCC 的危險(xiǎn)因素 （均P<0.01）。

2.2 甲基化結(jié)果

本研究主要對(duì)宿主基因組中的SOX-1 和PAX-1 進(jìn)行了甲基化檢測(cè)，494 例樣本甲基化總陽性率為16.40%（81/494），其中SOX-1 的陽性率為10.12%（50/494），PAX-1 的陽性率為15.18%（75/494），二者均陽性者44 例，占總陽性人數(shù)的54.32%（44/81）。

高危型HPV 感染、HPV 單一感染、HPV 持續(xù)感染以及具有HPV 感染病史，均為甲基化陽性的危險(xiǎn)因素（均P<0.01）。具體見表2。

2.3 HPV37 分型檢測(cè)和甲基化檢測(cè)的診斷效能

以組織病理學(xué)診斷≥HSIL 為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算2種方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值；同時(shí)分析了在≥HSIL 病例中，甲基化檢測(cè)對(duì)HPV 檢測(cè)陽性的分流作用。表3 示，甲基化檢測(cè)聯(lián)合HPV37 分型檢測(cè)極大提高了對(duì)≥HSIL 病變篩查的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值。

3 討論

盡管存在宮頸癌疫苗、 常規(guī)篩查以及針對(duì)宮頸癌前病變的規(guī)范化治療等多種預(yù)防和干預(yù)措施，宮頸癌仍然是全球女性的第四大常見腫瘤[1]。據(jù)報(bào)道[4]，我國(guó)每年約有新發(fā)病例10.6 萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)約18.6%，伴隨生活節(jié)奏的加快以及人們對(duì)性行為思想的開放，宮頸癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)逐漸年輕化趨勢(shì)。

根據(jù)HPV 致病能力的不同，可分為低危型、中危型和高危型；據(jù)感染方式不同，又分為單一感染和復(fù)合感染（2 種及以上HPV 亞型同時(shí)感染）。多年來，隨著對(duì)宮頸癌病因?qū)W研究的深入，宮頸癌作為一種感染性惡性腫瘤，是可防可控的。目前發(fā)現(xiàn)的HPV 基因型多達(dá)200 多種，世界范圍內(nèi)最常見HPV 基因型是HPV16 型，它也是高危型HPV基因型的最主要類型[5]。

我們研究發(fā)現(xiàn)，就診宮頸病變機(jī)會(huì)性門診的患者，以高危型HPV 感染為主，總感染頻率為63.36%（313/494）；HPV 單一感染人群中，高危型HPV 感染占82.18%（143/174）。結(jié)合組織病理學(xué)診斷，我們發(fā)現(xiàn)從LSIL 開始，癌變程度重的人群，HPV 感染率增加，在鱗狀細(xì)胞癌和腺細(xì)胞癌中的感染率為100%，HPV 感染增加了≥HSIL 病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；SCC 共3 例，均為高危型HPV 單一型感染（100%）。值得注意的是HPV16 作為感染率最高的HPV 亞型，單一感染致病作用較強(qiáng)，是HSIL 和SCC 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究SCC 3例，均為HPV16 型單一感染所致，提示HPV16 的致病性不可小覷，這可以很好的解釋在美國(guó)陰道鏡和病理協(xié)會(huì) （American Society of Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP） 指南中將HPV16分型陽性與其他高危型HPV 分型區(qū)別開來，無論細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果如何都要進(jìn)行陰道鏡下活檢的必要性[6]。

有研究表明[2]，多達(dá)80%的女性在一生中會(huì)感染HPV，但僅有一小部分感染者進(jìn)展為惡性病變，這提示我們應(yīng)該還有其他因素參與調(diào)節(jié)了宮頸感染發(fā)展為惡性腫瘤的過程。癌基因和抑癌基因的突變及表觀遺傳學(xué)改變是參與腫瘤發(fā)生進(jìn)展的重要機(jī)制。DNA 甲基化是最常見的基因表觀遺傳學(xué)改變[7]，發(fā)生于腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)域，造成該基因的轉(zhuǎn)錄失活，從而促使腫瘤的發(fā)生[8]。

本研究HPV 檢測(cè)總感染率達(dá)到63.36%，最終組織病理學(xué)診斷在HSIL 及以上的僅占23.89%（118/494）。因此，我們?cè)贒NA 甲基化方面也進(jìn)行了初步探討。

本研究中甲基化選取的是PAX-1 和SOX-1 2 個(gè)基因的甲基化位點(diǎn)。（1）配對(duì)盒基因轉(zhuǎn)錄因子家族成員PAX1，定位于染色體20p11，主要參與生骨節(jié)的分化，在哺乳動(dòng)物脊柱和胚胎細(xì)胞的增殖控制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。早在2008年，有研究發(fā)現(xiàn)[10]，PAX1 基因在宮頸癌中出現(xiàn)甲基化異常，PAX-1 基因在宮頸癌中因啟動(dòng)子趨于甲基化而表達(dá)抑制失活，經(jīng)去甲基化處理后基因可重新表達(dá)，PAX1 基因甲基化改變?cè)趯m頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN） III 及浸潤(rùn)性宮頸癌患者的宮頸脫落細(xì)胞中被檢測(cè)到。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[11～13]在浸潤(rùn)性癌的鑒別中PAX1基因檢測(cè)的甲基化指數(shù)特異性更佳，而在CINⅢ以上病變的篩查中特異度亦具有明顯的優(yōu)勢(shì)。（2）SOX1 為性別決定區(qū)域Y1，它定位于染色體13q34 上，具有參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)以及決定細(xì)胞存亡的功能[14，15]。既往有研究表明，SOX-1 基因在肺癌[16]、肝癌[17]、卵巢癌[18]、食管癌[19]等多種惡性腫瘤中甲基化水平增高，2016年的一項(xiàng)Meta 分析表明[20]SOX-1 基因甲基化在宮頸癌檢測(cè)中具有較高的敏感性，可望成為一個(gè)潛在的宮頸癌篩查的分子標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)HPV 感染是甲基化陽性的危險(xiǎn)因素，包括高危型HPV 感染、HPV 單一感染、HPV持續(xù)感染以及具有HPV 感染史者； 而HPV16 型感染，是37 個(gè)亞型中唯一的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這進(jìn)一步提醒我們?cè)诤Y查的過程中，遇到HPV16 陽性者應(yīng)當(dāng)給予高度重視，增加患者的隨訪以及給予積極的臨床處理。

本研究比較了HPV 和甲基化2 種檢測(cè)方法對(duì)≥HSIL 病變的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，發(fā)現(xiàn)甲基化檢測(cè)對(duì)HPV37 分型檢測(cè)的分流效果明顯，可以大幅度增加篩查≥HSIL 病變的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值，分別達(dá)到了97.6%和96.3%； 本研究結(jié)果證明甲基化檢測(cè)陽性結(jié)果更具臨床意義，可以更好地輔助HPV 檢測(cè)篩查≥HSIL 病變。但是甲基化檢測(cè)陰性結(jié)果的解釋，需要更多臨床數(shù)據(jù)支持，如何對(duì)其進(jìn)行管理，有待于進(jìn)一步研究。