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刺五加-云芝乙醇提取物對(duì)小鼠抗抑郁作用

2021-06-15 04:59:52王麗紅孟卓異林麗穎宮益霞孫長海
食品工業(yè)科技 2021年11期
關(guān)鍵詞:懸尾刺五加抗抑郁

王麗紅,孟卓異,林麗穎,宮益霞,張 宇,孫長海,趙 宏

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

抑郁癥是一種常見的精神疾病,會(huì)對(duì)生活產(chǎn)生負(fù)面影響。三分之二的抑郁癥患者會(huì)產(chǎn)生自殺念頭,自殺率從10%~15%不等?;?950年代單胺神經(jīng)遞質(zhì)(如5-羥色胺或去甲腎上腺素)的偶然發(fā)現(xiàn),到目前為止,對(duì)抑郁癥的治療完全取決于抗抑郁藥,而這些抗抑郁藥只對(duì)約50%的患者完全起效[1]。因此,迫切需要更有效的抗抑郁藥。

刺五加為東北道地藥材五加科植物刺五加(Acanthopanax senticosus(Rupr. et Maxim.) Harms)的干燥根及根莖或莖。在西伯利亞大河地區(qū)被稱為“西伯利亞人參”,在中國、韓國、俄羅斯和日本普遍用作傳統(tǒng)中草藥[2?4]。刺五加的根、根莖和莖枝可以通過干擾抑郁癥大鼠腦中五羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)關(guān)鍵酶的表達(dá)來產(chǎn)生抗抑郁作用[5]。云芝(Coriolus versicolor(L. ex Fr.) Quel)在東方醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用歷史悠久,也被稱為“火雞尾巴”,是一種專性需氧菌,常出現(xiàn)在樹干、樹枝、枯枝和樹樁上。云芝早在《本草綱目》中就有記載,在中國已有超過400年的藥用歷史。云芝提取物具有多種生物學(xué)活性,包括抗微生物、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝和抗腫瘤等[6?7]。

刺五加和云芝長期以來一直作為具有鎮(zhèn)靜催眠和提高免疫力的保健食品被廣泛研究及應(yīng)用[8?12],但將兩者進(jìn)行配伍使用的研究尚無記載。刺五加作為寧心安神類藥物在中國藥典中記載的中藥復(fù)方中僅有腦靈液一種。本課題將刺五加與云芝兩者配伍使用,主要研究二者聯(lián)用的抗抑郁作用、聯(lián)用的最適劑量以及抗抑郁的作用機(jī)制,旨在獲得一種天然的,毒副作用低的對(duì)抑郁癥有治療作用的保健藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加及云芝 均采自黑龍江,經(jīng)鑒定為正品;無水乙醇、冰乙酸 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;氯化鈉注射液 吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司;利血平 阿拉丁試劑上海有限公司,≥99.5%;鹽酸氟西汀 蘇州中化藥品工業(yè)有限公司;鼠5-HT ELISA KIT 、鼠去甲腎上腺素(NE)ELISA KIT、鼠白細(xì)胞介素IL-10、IL-1βELISA KIT 上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):CK-E20162;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性昆明小鼠,體重18~22 g 由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供,合格證書SCXK(黑)-2013-001。

臺(tái)式低速離心機(jī)、酶標(biāo)儀 賽默飛世爾上海儀器有限公司;FA2004型分析天平儀 上海越平科學(xué)儀器蘇州制造有限公司;SK5210HP型超聲波清洗器

上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;FW-177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 刺五加和云芝按生藥量配比分為刺五加組(AS)、云芝組(CV),刺五加和云芝不同配比組(AC-1:1、AC-1:2、AC-1:3、AC-1:4、AC-1:5、AC-5:1、AC-4:1、AC-3:1、AC-2:1),精確稱取的各配伍比例的刺五加和云芝粉末共11.25 g,將原料粉末置于錐形瓶中,使用75%乙醇溶液為提取溶劑,液料比為25:1(mL/g),浸泡過夜后采用超聲輔助提取法,超聲功率120 W,提取時(shí)間2 h,提取液濃縮后使用生理鹽水定容至25 mL容量瓶中,制成濃度為0.45 g/mL的混懸液,以待使用。。

1.2.2 動(dòng)物分組給藥及小鼠抑郁模型的建立

1.2.2.1 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性昆明小鼠,體重18~22 g。給藥前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。小鼠按體重隨機(jī)進(jìn)行分組,設(shè)空白組、對(duì)照組、模型組,刺五加組,云芝組,刺五加-云芝不同配比組(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、4:1、3:1、2:1)共14組,每組10只,根據(jù)小鼠給藥劑量每日早間灌胃一次不同配比組提取液。小鼠給藥劑量按人類最大給藥劑量乘以9.1進(jìn)行換算為4.55 mg·kg?1。懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組及各給藥組;利血平拮抗實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、模型組及各給藥組。在實(shí)驗(yàn)過程中,空白組及模型組灌胃生理鹽水,陽性對(duì)照組灌胃鹽酸氟西汀溶液(20 mg·kg?1),連續(xù)灌胃14 d。

1.2.2.2 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn) 灌胃給藥第12 d,按照Steru[13?14]的方法,灌胃給藥后將小鼠放置于實(shí)驗(yàn)室60 min,使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),將小鼠尾巴尖端2 cm左右懸掛于實(shí)驗(yàn)裝置上,小鼠與底部有一段距離,使小鼠倒置空中時(shí)無所攀抓,經(jīng)一段時(shí)間后小鼠因失望而減少活動(dòng),模擬抑郁狀態(tài)建造小鼠行為絕望模型。實(shí)驗(yàn)總用時(shí)6 min,并記錄小鼠后4 min的懸尾不動(dòng)時(shí)間(小鼠在懸掛處完全停止掙扎或者有微小的肢體顫動(dòng))??疾觳煌o藥組對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間(TST)的影響。

1.2.2.3 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 在正式強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)24 h前,將小鼠放入實(shí)驗(yàn)設(shè)備中預(yù)游15 min,使小鼠適應(yīng)環(huán)境。灌胃給藥第13 d,給藥1 h后,將小鼠放置于水溫控制在(25.0±1.0)℃的塑料水槽中,水深至鼠四爪不可觸底,經(jīng)歷一段時(shí)間后,小鼠因放棄而大幅度減少活動(dòng)幅度以及活動(dòng)時(shí)間,活動(dòng)之間有長時(shí)間的不動(dòng)間歇為失望行為。實(shí)驗(yàn)總用時(shí)6 min,記錄后4 min的小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間[15]??疾觳煌o藥組對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間(FST)的影響。

1.2.2.4 利血平拮抗實(shí)驗(yàn) 灌胃給藥第14 d,根據(jù)Xu等[16?17]的利血平拮抗實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)照組、模型組和給藥組均于末次給藥后測量小鼠肛溫,并于1 h后腹腔注射利血平溶液(4 mg·kg?1)(精確稱量1 mg利血平粉末,加10%冰乙酸溶液定容至10 mL容量瓶,配制成0.1 mg·mL?1利血平溶液),空白組同時(shí)間腹腔注射等量生理鹽水。1 h后觀察小鼠上眼瞼下垂表現(xiàn)。眼瞼下垂有如下四個(gè)等級(jí),依此計(jì)算分?jǐn)?shù),眼全閉為4分,眼閉3/4為3分,眼閉1/2為2分,眼閉1/4為1分。2 h后測小鼠肛溫,以將體溫計(jì)探頭完全插入小鼠肛門,至少維持2 min[16?17]。

1.2.3 血樣及腦的采集與測定 在利血平拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后將小鼠脫頸處死,期間小鼠禁食。實(shí)驗(yàn)時(shí)眼球取血后斷頭取小鼠大腦0.2 g置于生理鹽水中冰浴勻漿,10000 r/min的條件下離心,離心15 min,取上清液,依照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書采用ELISA法測定血清中IL-10、IL-1β及小鼠腦中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE的含量[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)多指標(biāo)綜合分析法,整合多個(gè)檢測指標(biāo)。評(píng)分時(shí)小鼠懸尾及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以對(duì)照組為參照,其余實(shí)驗(yàn)組以模型組為參照,各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,即標(biāo)化值=(給藥組?對(duì)照組或模型組)/(正常組?對(duì)照組或模型組)。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響

結(jié)果如表1所示。從結(jié)果中可以看出,與空白組比較,不同給藥組均能縮短小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間。除云芝組、刺五加與云芝比例為1:5、3:1、2:1組外,其余各實(shí)驗(yàn)組均P<0.05,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從對(duì)小鼠懸尾行為影響來看,與空白組相比,刺五加-云芝1:2比例組極顯著(P<0.01)降低了不動(dòng)時(shí)間,組間兩兩比較,1:1和1:2劑量組無顯著性差異(P>0.05)。從對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳行為影響來看,與空白組相比,1:2比例組極顯著降低小鼠不動(dòng)時(shí)間極顯著(P<0.01),組間兩兩比較,1:1和1:2比例組無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同配比組均能夠明顯縮短小鼠不動(dòng)時(shí)間,其中刺五加與云芝比例為1:2時(shí)效果最好,其次為1:1。刺五加-云芝1:1和1:2比例組實(shí)驗(yàn)效果略次于陽性對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同配比組對(duì)小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響(n=10, ±s)Table 1 Effects of all groups on immobility time in TST and FST in mice (n=10, ±s)

表1 不同配比組對(duì)小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響(n=10, ±s)Table 1 Effects of all groups on immobility time in TST and FST in mice (n=10, ±s)

注:同列不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;表2~表4同。

組別 懸尾不動(dòng)時(shí)間(s) 游泳不動(dòng)時(shí)間(s)陽性對(duì)照 72.65±1.23d 57.65±1.23f空白 123.62±9.54a 108.62±9.54a 1:1 88.62±4.18cd 73.28±4.48def 1:2 85.36±7.01cd 69.36±5.80ef 1:3 101.31±1.35bc 85.65±2.52cde 1:4 100.30±6.01bc 85.70±5.35cde 1:5 107.71±5.17ab 95.24±5.03abc 5:1 91.98±11.70bc 77.69±11.74cde 4:1 101.08±12.40bc 85.67±12.58cde 3:1 122.40±20.52a 107.29±20.64ab 2:1 108.54±12.02ab 94.33±13.40abc刺五加 100.18±8.89bc 84.94±8.61cde云芝 108.52±7.54ab 90.10±2.26bcd

表2 對(duì)抑郁模型小鼠體溫及眼瞼下垂的影響(n=10, ±s)Table 2 Effects of body temperature and blepharoptosis in depression model mice (n=10, ±s)

表2 對(duì)抑郁模型小鼠體溫及眼瞼下垂的影響(n=10, ±s)Table 2 Effects of body temperature and blepharoptosis in depression model mice (n=10, ±s)

組別 給藥2 h后肛溫(℃) 眼瞼下垂評(píng)分陽性對(duì)照 36.7±0.2dbc 1.88±0.83bcd空白 37.5±0.6a 0.00±0.00e模型 35.5±0.4f 3.38±0.52a 1:1 36.7±0.3b 1.63±0.74cd 1:2 36.9±0.3bc 1.50±0.76d 1:3 36.5±0.2bcde 1.63±0.52cd 1:4 36.6±0.2bcde 2.00±0.93bcd 1:5 36.3±0.4cde 1.88±0.83bcd 5:1 36.4±0.5bcde 2.00±0.93bcd 4:1 36.2±0.3de 2.38±0.92bcd 3:1 36.3±0.6cde 2.50±0.76bc 2:1 36.4±0.2cde 1.88±0.83bcd刺五加 36.4±0.3cde 2.00±1.07bcd云芝 36.1±0.4e 2.63±1.06ab

2.2 對(duì)小鼠眼瞼下垂和體溫的影響

結(jié)果如表2所示。從結(jié)果中可以看出,模型組腹腔注射利血平后,與空白組比較,模型組小鼠體溫極顯著降低,眼瞼下垂評(píng)分極顯著升高(P<0.01),證明此次造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同劑量組均能明顯降低眼瞼下垂評(píng)分以及抑制小鼠體溫下降,且與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05,P<0.01),證明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在抑制小鼠體溫下降和眼瞼下垂實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,1:2比例組效果最佳。

2.3 對(duì)小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影響

結(jié)果見表3。與空白組相比,模型組小鼠血清中IL-10濃度降低,具有極顯著性差異(P<0.01)證明造模成功。與模型組相比,除5:1和4:1組外,各劑量組均能不同程度提高小鼠血清中IL-10的含量。各組中刺五加-云芝比例為1:2中IL-10水平最高,1:1組次之,兩組組間無顯著差異(P>0.05)。與空白組相比,模型組小鼠血清中IL-1β濃度明顯升高,與空白組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,刺五加-云芝劑量組1:1、1:2、1:3、1:4、1:5,能明顯降低小鼠血清中IL-1β的含量,且與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 對(duì)小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影響(n=10, ±s)Table 3 Effect of serum IL-10 and IL-1β content in mice (n=10, ±s)

表3 對(duì)小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影響(n=10, ±s)Table 3 Effect of serum IL-10 and IL-1β content in mice (n=10, ±s)

組別 IL-10(pg·mL?1) IL-1β(pg·mL?1)陽性對(duì)照 711.56±35.56abc 106.72±0.19abc空白 761.56±18.95a 78.87±2.24f模型 567.11±30.87ef 122.29±17.64a 1:1 729.70±37.22ab 83.04±7.60df 1:2 731.93±94.19ab 79.64±17.44f 1:3 704.89±37.47abc 84.79±3.62cde 1:4 653.41±8.98bcd 89.84±16.92bcdf 1:5 666.00±9.62bcd 86.55±5.17cde 5:1 564.52±50.69ef 92.36±5.36abcde 4:1 551.56±4.44f 102.55±4.75bcd 3:1 616.37±7.80def 96.96±5.79abcde 2:1 640.44±36.87cde 98.50±9.88abcd刺五加 606.37±17.96def 109.57±0.33ab云芝 668.22±102.15bcd 100.69±11.69abcd

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),小鼠抑郁模型能改變小鼠血清中炎性因子IL-10、IL-1β的含量,使IL-10降低,IL-1β升高。刺五加-云芝配比組能抑制這種效果,且刺五加-云芝比例為1:1、1:2時(shí)作用明顯。且從兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,刺五加-云芝比例為1:1、1:2時(shí)抑制IL-1β的含量升高的作用效果明顯優(yōu)于對(duì)照組,兩組與陽性對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05,P<0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 對(duì)小鼠腦內(nèi)5-HT和NE含量的影響(n=10, ±s)Table 4 Effect of 5-HT and NE contents in mice brain (n=10, ±s)

表4 對(duì)小鼠腦內(nèi)5-HT和NE含量的影響(n=10, ±s)Table 4 Effect of 5-HT and NE contents in mice brain (n=10, ±s)

組別 5-HT(ng·mL?1) NE(ng·mL?1)陽性對(duì)照 299.77±21.13c 6.25±0.40abc空白 308.92±17.31c 5.62±0.64abcd模型 178.40±5.47fg 4.02±0.37e 1:1 371.13±88.59b 6.47±0.9ab 1:2 498.83±6.07a 6.63±0.88a 1:3 252.35±10.66de 5.76±0.41abcd 1:4 164.08±3.66h 5.09±0.46d 1:5 195.54±10.78efg 5.27±0.35cd 5:1 208.45±13.44defg 5.32±0.79cd 4:1 236.15±4.47def 5.55±0.48abcd 3:1 242.02±19.94def 5.36±1.05bcd 2:1 243.90±15.51def 5.43±0.61bcd刺五加 263.15±8.69cd 5.95±0.47abcd云芝 218.08±2.93cdef 4.91±0.67de

2.4 對(duì)小鼠腦中5-HT和NE含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。與空白組相比,模型組小鼠腦中5-HT、NE濃度顯著降低,證明模型建立成功。按小鼠腦中5-HT含量結(jié)果分析,與其他劑量組相比,刺五加-云芝比例為1:2時(shí)作用效果最好,1:1次之,與模型組相比有極顯著性差異(P<0.01),且兩組治療效果明顯優(yōu)于對(duì)照組及刺五加、云芝單味藥組,組間比較具有顯著性差異(P<0.05)。按小鼠腦中NE含量結(jié)果分析,與其他劑量組相比,刺五加-云芝比例為1:2時(shí)作用效果最好,與模型組相比有極顯著性差異(P<0.01)。

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在刺五加-云芝不同配比組對(duì)小鼠腦中5-HT和NE含量的影響實(shí)驗(yàn)中,最佳的配伍比例為1:2,且在對(duì)小鼠腦中5-HT影響實(shí)驗(yàn)中1:2比例組作用效果明顯優(yōu)于對(duì)照組,組間具顯著性差異(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 抗抑郁作用各檢測指標(biāo)總效應(yīng)

根據(jù)多指標(biāo)綜合分析法,整合多個(gè)檢測指標(biāo)。評(píng)分時(shí)小鼠懸尾及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以對(duì)照組為參照,其余實(shí)驗(yàn)組以模型組為參照,各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,即標(biāo)化值=(給藥組?對(duì)照組或模型組)/(空白組?對(duì)照組或模型組)。參考專家評(píng)分,本研究確定各指標(biāo)系數(shù)為:懸尾及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間為2,體溫及眼瞼下垂評(píng)分為1,IL-10和IL-1β為1、5-HT、NE為3。各指標(biāo)數(shù)據(jù)的標(biāo)化值乘以各自權(quán)重系數(shù)后的加合值即得刺五加-云芝不同配伍比例對(duì)于抑郁癥模型小鼠治療作用的總效應(yīng)值(TE)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示,綜合各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,各不同配伍比例組1:1、1:2、1:3治療效果最佳且明顯優(yōu)于刺五加單味藥組,其中刺五加-云芝比例為1:2是總效應(yīng)值(TE)最高,證明其是抗抑郁作用最優(yōu)配伍。

3 討論與結(jié)論

抑郁癥病因復(fù)雜,最著名的假說為多種胺代謝障礙假說,其認(rèn)為5-HT水平的下降,是抑郁癥患者和躁狂病人發(fā)生的共同基礎(chǔ),5-HT水平的下降只是容易引起情感方面的障礙。抑郁癥的發(fā)病則需NE功能改變的參與,5-HT參與其中兩者相互作用,引起癥狀。中樞腦內(nèi)5-HT和NE水平均下降,就會(huì)引起抑郁癥的發(fā)生;另有研究證明抑郁癥的發(fā)生與機(jī)體免疫功能有著密切聯(lián)系,炎性因子及促炎因子白細(xì)胞介素含量的變化能夠反應(yīng)出機(jī)體抑郁癥的致病程度,通過降低促炎性細(xì)胞因子或增強(qiáng)抗炎因子的活性,均能降低IDO過度表達(dá),減少抑郁癥狀的發(fā)生[19?21]。

黃芷熠等[22]將刺五加-山楂按照不同比例配伍,通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、利血平拮抗實(shí)驗(yàn)觀察其提物對(duì)抑郁癥模型小鼠的影響。將其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與刺五加-云芝抗抑郁能力進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn),二者均具有良好的抗抑郁作用,本文結(jié)果表明,與單獨(dú)使用刺五加和云芝相比,刺五加-云芝組可使小鼠血清中的IL-10水平和海馬中的5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)水平顯著升高(P<0.05),同時(shí)IL-1β降低。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證明刺五加-云芝配伍使用對(duì)各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)具有明顯的改善作用,刺五加-云芝配伍后抗抑郁作用效果高于單用,同時(shí)優(yōu)于陽性對(duì)照組鹽酸氟西汀,二者配伍使用后發(fā)揮了協(xié)同增效的作用,兩者最佳配伍比例為1:2。上述研究結(jié)果可為抑郁癥的臨床治療及抗抑郁藥物的篩選、開發(fā)和利用提供的新的思路和理論基礎(chǔ)。

表5 不同比例配伍的刺五加-云芝標(biāo)化值和總效應(yīng)值Table 5 Standardized indexes and total effect values of the investigated Acanthopanax senticosus-Coriolus versicolor

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