邱萌萌 吳玉斌 陸洪省

摘 要 采用含毒介質(zhì)法研究枯草芽孢桿菌對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制能力，采用高通量測(cè)序的方法探究枯草芽孢桿菌對(duì)土壤浸出液中真菌菌群群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到100%;在門分類水平上，枯草芽孢桿菌會(huì)明顯改變土壤浸出液中真菌菌群的群落結(jié)構(gòu)。因此，枯草芽孢桿菌可作為生防菌廣泛應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌;含毒介質(zhì)法;高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S476;S154.36 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.03.084

芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢(shì)生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌中性狀優(yōu)良的分離株，其生理特征多樣，在自然界中廣泛分布，極易分離培養(yǎng)。枯草芽孢桿菌不僅可以廣泛存在于土壤、植物根際表面和其他外部環(huán)境中，而且可以存在于植物體內(nèi)，是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細(xì)菌，尤其是在植物的根部、莖部。該菌不僅對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境，而且能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力?？莶菅挎邨U菌可通過成功定殖至植物根際、體表或體內(nèi)的方式，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)植物周圍的營(yíng)養(yǎng)，分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，改變植物根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到生防的目的，已成為一種理想的生防細(xì)菌[1-3]。

高通量測(cè)序技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的新一代測(cè)序技術(shù)，與傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、Biolog平板法、磷脂脂肪酸、PCR-DGGE和RFLP等分析方法相比，具有通量高、靈敏度高、準(zhǔn)確性高和運(yùn)行成本低等特點(diǎn)。高通量測(cè)序技術(shù)通過檢測(cè)土壤微生物細(xì)胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)（原核微生物16S rRNA、真核微生物18S rRNA）的堿基序列，可以更全面、準(zhǔn)確地分析土壤中微生物群落的多樣性，已廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落的研究中[4-6]。本研究通過枯草芽孢桿菌與致病菌的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證枯草芽孢桿菌的抑菌作用，通過高通量測(cè)序的方法探究枯草芽孢桿菌對(duì)土壤中微生物群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（1 000億孢子/g）由河北冠龍農(nóng)化有限公司提供;茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌為山東科技大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室之前分離得到的菌株;土樣由山東省安丘市萬芳蔬菜種植大棚提供。

枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：20 g葡萄糖、15 g蛋白胨、5 g氯化鈉、0.5 g牛肉膏、1 000 mL水。固體培養(yǎng)基按20%的比例加入瓊脂即可。

茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.2 菌株的分離鑒定

取5 g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑于10 mL無菌水中搖勻、溶解。利用無菌接種環(huán)蘸取枯草芽孢桿菌溶液在枯草芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上劃線接種，重復(fù)3個(gè)。將接種完成的培養(yǎng)基于自然光、28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)、觀察。待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出菌落后，挑選與枯草芽孢桿菌顏色形態(tài)一致的菌落，委托青島睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)室保存的茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌進(jìn)行活化培養(yǎng)后，采用含毒介質(zhì)法觀察枯草芽孢桿菌對(duì)兩種致病菌的抑制作用。

將分離得到的枯草芽孢桿菌接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，5 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用0.22 μm的無菌濾膜過濾得無菌濾液。PDA固體培養(yǎng)基在無菌滅菌鍋中滅菌，冷卻至60 ℃時(shí)，分別按枯草芽孢桿菌無菌濾液與PDA培養(yǎng)基體積比為1∶3和1∶9的比例制成含毒培養(yǎng)基，倒入提前滅菌好的培養(yǎng)皿中冷卻，備用。

在不同比例的含毒培養(yǎng)基的中心處分別接入直徑為9 mm的茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌菌餅，以不加枯草芽孢桿菌無菌濾液的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每組重復(fù)3次。在自然光、28 ℃條件下培養(yǎng) d，觀察枯草芽孢桿菌對(duì)病原菌的抑制作用，計(jì)算抑制率，見公式（1）。

1.4 高通量測(cè)序

取5 g土樣于50 mL水中攪拌、溶解，靜置6 h取上清液得土壤浸出液。

分別取1 mL土壤浸出液于兩個(gè)100 mL錐形瓶中，其中一個(gè)加入20 mL枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基，另一個(gè)加入20 mL枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基后再加入1 mL枯草芽孢桿菌培養(yǎng)2 d的培養(yǎng)液作為對(duì)照。培養(yǎng)7 d后委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，分析枯草芽孢桿菌對(duì)土壤真菌菌群群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。

1.5 數(shù)據(jù)整理

利用Word 2010、Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制圖、制表，利用MEGA5.1進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株系統(tǒng)分類學(xué)鑒定

將測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫中各菌株序列進(jìn)行相似性分析，所測(cè)枯草芽孢桿菌菌株與Bacillus subtilis strain BS-S3菌株的一致性達(dá)99%。用MEGA5.1軟件對(duì)同源性較高的序列進(jìn)行序列分析并使用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。該序列和Bacillus subtilis strain BS-S3菌株在同一分支，結(jié)合其生物學(xué)特性及形態(tài)學(xué)特征，確定該菌株為枯草芽孢桿菌，并命名為SKD-QM11。

2.2 抑菌作用

經(jīng)過5 d培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，無論枯草芽孢桿菌和PDA培養(yǎng)基的比例為1∶3還是1∶9，對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的抑制作用都非常強(qiáng)，其抑制效果如圖2、3所示。采用十字交叉法對(duì)菌餅直徑進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn)，菌餅大小無變化，由抑制率公式得，枯草芽孢桿菌對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的抑制率達(dá)到100%。

2.3 對(duì)土壤真菌菌群的影響

由高通量測(cè)序結(jié)果得，加入枯草芽孢桿菌的土壤浸出液中OTU數(shù)為147，僅加入液體培養(yǎng)基的土壤浸出液中OTU數(shù)為20，說明加入枯草芽孢桿菌會(huì)豐富土壤中真菌菌群組成，使真菌種類增多。由表1可得，在門水平上，加入枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液與只加入培養(yǎng)基相比，真菌優(yōu)勢(shì)菌有所變化。只加入培養(yǎng)基的土壤浸出液中，變形菌門占了99.95%，幾乎所有真菌都屬于變形菌門;加入枯草芽孢桿菌的土壤浸出液中，變形菌門所占的比例為63.41%，較只加入培養(yǎng)基的土壤浸出液中變形菌門的比例小，但是莫氏菌門為20.09%，擔(dān)子菌門比例也有所增加，球囊菌門的真菌由無到有，雖然所占比例較小，但增加了真菌種類，說明加入枯草芽孢桿菌會(huì)改變土壤浸出液中門水平的真菌組成。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離出的枯草芽孢桿菌能夠抑制茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的菌絲生長(zhǎng)，對(duì)其產(chǎn)生的抑制作用可達(dá)到100%。吳穎等人發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌抑制茄鏈格孢菌菌絲和分生孢子的生長(zhǎng)[7]。李永剛等報(bào)道，枯草芽孢桿菌BS2的菌液成分及胞外蛋白能有效抑制灰葡萄孢菌的產(chǎn)孢、萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)[8]。黃華毅等人發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌菌液處理病原真菌后，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要通過溶解細(xì)胞壁或細(xì)胞膜造成原生質(zhì)泄漏使菌絲斷裂或畸形[9]?？莶菅挎邨U菌對(duì)植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，具有較好的開發(fā)前景。

由高通量測(cè)序結(jié)果可得，枯草芽孢桿菌會(huì)改變土壤浸出液中真菌菌群的組成，豐富真菌類別。陳雪麗等利用DGGE-PCR技術(shù)證明在盆栽條件下接種B.subtilis BRF-2和Paenibacillus polymyxa BRF-1對(duì)不同時(shí)期黃瓜和番茄根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，特別是對(duì)番茄根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大[10]。余賢美等人通過固體平板法和Biolog法分析了具有良好定殖能力的B.subtilis Bs-15對(duì)棗樹根際土壤中微生物的影響，發(fā)現(xiàn)其會(huì)提高土壤微生物的整體活性以及土壤微生物種群和功能多樣性[11]。在本研究中，針對(duì)真菌門分類水平，雖然優(yōu)勢(shì)菌種類未改變，但是所占比例有所改變，而且提高了其他種類真菌所占的比例，無論是土壤浸出液中的真菌種類還是真菌數(shù)量，均可被枯草芽孢桿菌明顯改變。

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（責(zé)任編輯：劉 昀）