許夢(mèng) 吳軍成

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（濟(jì)南 250000）

泰安市中心醫(yī)院（泰安 271000）

先天性小耳畸形是由于胚胎時(shí)期第一、二腮弓及第一腮溝的發(fā)育異常引起的外、中耳畸形[1]，由遺傳、環(huán)境、社會(huì)等多種因素共同影響，病理發(fā)育機(jī)制復(fù)雜[2]。先天性小耳畸形分為單純性和綜合征型小耳畸形，可以同時(shí)伴發(fā)多個(gè)器官的發(fā)育異常[1,3]?；颊叩亩炕紊婕巴舛笮?、形態(tài)異常或結(jié)構(gòu)畸形甚至缺失，嚴(yán)重者表現(xiàn)為無(wú)耳畸形伴外耳道閉鎖[4]。由于不同患者耳部畸形異質(zhì)性較高，使得超聲等常規(guī)產(chǎn)前檢查容易出現(xiàn)漏診等。調(diào)查顯示，不同種族、不同地域先天性小耳畸形的發(fā)病率不同，為0.83-17.4/10000不等[5]。盡管目前有大量研究探索其致畸病因，但該病的具體致病機(jī)制尚未明確，因此探求先天性小耳畸形的病因十分重要，可以為遺傳咨詢、分子水平的基因診斷提供更加可靠依據(jù)。國(guó)際上眾多專家學(xué)者致力于尋找小耳畸形的易感基因，但由于基因作用機(jī)制復(fù)雜，僅在綜合征型小耳畸形致病基因診斷中取得了一定成績(jī)，散發(fā)性單純小耳畸形的遺傳學(xué)研究進(jìn)展甚微[6]?；蛟\斷技術(shù)的飛速發(fā)展使人類(lèi)可以應(yīng)用多種方法探索先天性小耳畸形的致病基因。在本文中將針對(duì)現(xiàn)今四種主要的基因鑒定方法，在闡述其優(yōu)勢(shì)及局限性的同時(shí)，首次將基因檢測(cè)進(jìn)展以“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”的形式進(jìn)行總結(jié)探討，“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”是指在進(jìn)行分子水平的基因診斷時(shí)需要優(yōu)先考慮和進(jìn)行篩查的基因組，它應(yīng)該包括：已明確的綜合征型小耳畸形的致病基因；在人、豬、羊和鼠等小耳畸形模型中，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析已獲取的與顱面部發(fā)育有關(guān)的基因；與之相關(guān)的拷貝數(shù)變異；小鼠基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)中與之相關(guān)的致病基因等。以期研究者們?cè)谶M(jìn)行小耳畸形遺傳學(xué)研究時(shí)，可以利用該小耳畸形致病基因鑒定的系統(tǒng)性方法，并優(yōu)先從“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”中篩查致病基因，形成小耳畸形基因診斷的系統(tǒng)性方法和基因庫(kù)。

1 綜合征型小耳畸形調(diào)研

先天性小耳畸形可以單獨(dú)出現(xiàn)[7]，但約40%的患者伴發(fā)其他器官、結(jié)構(gòu)的先天畸形或發(fā)育異常[8]，如頜面部、心血管、泌尿系統(tǒng)等，其中部分以綜合征的形式存在，且已明確了致病基因。比如TCOF1的突變可以引起Treacher Collins綜合征[9]，SIX1和EYA1的突變導(dǎo)致鰓耳綜合征的發(fā)生[10]。

綜合征型小耳畸形致病基因的探索及其伴發(fā)畸形的相關(guān)研究極大的促進(jìn)了小耳畸形遺傳學(xué)的發(fā)展[11]。HMX1的突變可以導(dǎo)致眼耳綜合征的發(fā)生。而Cox等人通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HMX1基因下游的保守非編碼元件（conserved noncoding ele‐ment,CNE）突變可以組織特異性地增強(qiáng)HMX1的表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)證明保守區(qū)域的突變可能通過(guò)對(duì)特定基因的調(diào)節(jié)作用引起單純性小耳畸形[5]。Gold‐enhar綜合征又稱為oculo-auricular-vertebral spectrum（OAVS）或hemifacial microsomia（HFM），Kelberman等對(duì)兩個(gè)患病家系進(jìn)行了全基因組掃描、連鎖分析，認(rèn)為最為可能的候選基因?yàn)镚SC（goosecoid，OMIM：138890）。然而在另外兩個(gè)家系和120個(gè)散發(fā)病例中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GSC基因突變[12]。虞佩等人對(duì)43例先天性小耳畸形患者的GSC基因進(jìn)行了測(cè)序，其中2例患者在該基因的外顯子3的125bp處發(fā)生了錯(cuò)義突變。Luquetti等學(xué)者發(fā)現(xiàn)了10種有意義的小耳畸形優(yōu)先伴發(fā)畸形，如唇腭裂、后鼻孔閉鎖和軸前多指等。其中后鼻孔閉鎖和軸前多指在OAVS中并不常見(jiàn)，表明兩者與小耳畸形之間可能存在較為隱匿的遺傳發(fā)育聯(lián)系，并推測(cè)這些特定的優(yōu)先伴發(fā)組合可能是SALL1、FGF10/FGF2-3參與的基因路徑下游的缺陷或與該路徑相交叉的缺陷造成的。在最近研究中，Shankar等學(xué)者通過(guò)對(duì)OAVS患者血樣分析發(fā)現(xiàn)，先證者AMI‐GO2(c.901C＞T)基因產(chǎn)生無(wú)義替換，而在ZCCHC14(c.1198C＞T)和 SZT2(c.2951C＞T)上產(chǎn)生錯(cuò)義替換，AMIGO2基因的無(wú)義替換引入了一個(gè)過(guò)早終止密碼子，可能通過(guò)無(wú)義介導(dǎo)的通路衰變使該基因失去功能，因此相較于ZCCHC14和SZT2的錯(cuò)義替換而言，AMIGO2基因被認(rèn)為是一個(gè)更強(qiáng)的候選基因[12]。

由于小耳畸形的伴發(fā)畸形多樣，綜合征表型異質(zhì)性高、數(shù)量龐大、最低診斷標(biāo)準(zhǔn)尚存爭(zhēng)議。當(dāng)患者首次就診時(shí)，醫(yī)師應(yīng)考慮到綜合征型小耳畸形的可能性，對(duì)其進(jìn)行詳盡的全身檢查評(píng)估，發(fā)現(xiàn)隱匿的合并畸形，確定器官異常的特征性組合模式，從而做出準(zhǔn)確診斷。小耳畸形及其伴發(fā)畸形的診斷準(zhǔn)確性十分關(guān)鍵，一旦對(duì)表型發(fā)生漏判、誤判，將會(huì)影響接下來(lái)對(duì)基因突變檢測(cè)結(jié)果的解讀。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的綜合征型小耳畸形的致病基因是目前已知的在耳部甚至是顱面部發(fā)育中起著重要作用的基因，因此可以最先從這些致病基因入手對(duì)單純性患者進(jìn)行篩查。另外鑒于小耳畸形伴發(fā)畸形可能存在共同起源或致病機(jī)制，因此臨床上需要詳細(xì)記錄伴發(fā)畸形及其發(fā)生模式，或許可以為小耳畸形病因研究提供線索。

通過(guò) Pubmed，Science Direct和 Web of Science等途徑，檢索收集已報(bào)道的與小耳畸形相關(guān)的主要綜合征及其致病基因，見(jiàn)表1。

表1 主要的綜合征型小耳畸形及其已知致病基因。Table 1 Major human disorders and syndromes with microtia

2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

早期針對(duì)小耳畸形的候選基因研究存在樣本量少、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，且小耳畸形致病機(jī)制復(fù)雜，單基因病連鎖分析等方法難以奏效。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study,GWAS）指在全基因組層面上，開(kāi)展多中心、大樣本、反復(fù)驗(yàn)證的基因與疾病的關(guān)聯(lián)研究，是通過(guò)對(duì)大規(guī)模群體DNA樣本進(jìn)行全基因組高密度遺傳標(biāo)記分型，全面尋找揭示與疾病相關(guān)的遺傳因素的方法[30]。

除了人外，表現(xiàn)為小耳畸形的羊等動(dòng)物的GWAS檢測(cè)也為小耳畸形病因檢測(cè)提供了線索[31]。He S等通過(guò)對(duì)患有小耳畸形的羊類(lèi)以及正常羊類(lèi)的食道基因分型，在Oar6上發(fā)現(xiàn)了SNP接近HMX1基因的進(jìn)化保守區(qū)域，這與其他物種如牛和大鼠的外耳先天性畸形有關(guān)。對(duì)圍繞著HMX1的進(jìn)化保守區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的重復(fù)長(zhǎng)度為76bp，與小耳畸形一致，提示為顯性遺傳模式[32]。另外，過(guò)去對(duì)小耳畸形羊進(jìn)行的2例GWAS在同一個(gè)染色體上不同的基因上發(fā)現(xiàn)了顯著相關(guān)信號(hào)[33,34]。從文獻(xiàn)報(bào)道獲取在人、豬、羊和鼠等動(dòng)物模型中與顱面部發(fā)育有關(guān)的基因匯總見(jiàn)表2。

表2 不同種動(dòng)物中與顱面發(fā)育相關(guān)的基因Table 2 Genes associated with craniofacial development in different animals

作為一個(gè)復(fù)雜疾病，小耳畸形的病因研究困難重重。GWAS可以在小耳畸形基因組學(xué)研究中充分發(fā)揮優(yōu)勢(shì)：1）無(wú)需提前選定候選基因；2）可通過(guò)家系樣本等，識(shí)別其致病基因；3）可作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)；4）對(duì)其進(jìn)行基因分型，利于產(chǎn)前診斷及預(yù)防。但是由于在研究設(shè)計(jì)上GWAS強(qiáng)調(diào)對(duì)全基因組常見(jiàn)遺傳變異的覆蓋率，需要足夠多患者的多代遺傳大家系或大樣本表型一致的散發(fā)患者，主要檢測(cè)人群中頻率相對(duì)較高（＞5%）的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNPs），因此低頻、罕見(jiàn)變異可能被遺漏，并且其只對(duì)統(tǒng)計(jì)上與疾病最顯著相關(guān)的基因位點(diǎn)進(jìn)行研究，從而低估基因網(wǎng)絡(luò)和環(huán)境因素的影響。這就需要國(guó)內(nèi)外建立多中心、數(shù)據(jù)共享合作的出生缺陷監(jiān)管機(jī)構(gòu)，詳細(xì)地鑒別患者間的表型差異、并歸類(lèi)為不同的亞型。在目前得到的GWAS基因檢測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上，依靠樣本量的增加，尋找不同樣本之間存在同一突變基因的可能性，從而獲得致病基因的鑒定。

3 拷貝數(shù)變異檢測(cè)

Balikova等在一個(gè)常染色體顯性遺傳的綜合征型小耳畸形家系中，通過(guò)連鎖分析、熒光原位雜交技術(shù)、qPCR等方法在4號(hào)染色體p16區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)750kb的5次串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)變異（copy number variants,CNV）[38]，這是首次在基因組結(jié)構(gòu)水平觀測(cè)到小耳畸形患者存在CNV，就此CNV走進(jìn)了小耳畸形研究者們的視線?？截悢?shù)變異是指與參考序列相比，基因組中≥1kb的DNA片段插入、缺失或擴(kuò)增，及其互相組合衍生出的復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)變異[39]。其形成的直接原因是DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)誤導(dǎo)致復(fù)制叉中止及模板的轉(zhuǎn)換[40]，進(jìn)而造成基因片段的缺失、重復(fù)、移位和倒位等，直接或間接改變基因表達(dá)的量，進(jìn)而影響基因的表達(dá)[41]。例如Ana Beleza-Meireles等人對(duì)22名OAVS患者的DNA樣本進(jìn)行了比較基因組雜交（comparative genomic hybridization array screening,aCGH），在22號(hào)染色體的q11區(qū)域發(fā)現(xiàn)了頻發(fā)劑量異常。他們猜測(cè)這些不交叉或部分交叉的CNV可能增加了OAVS的患病風(fēng)險(xiǎn)[42]。

在表3中匯總了在人所有染色體中篩選出的與先天性耳畸形相關(guān)的CNVs類(lèi)型和位置，從另一個(gè)層面上豐富了小耳畸形的“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”。

表3 人類(lèi)全部染色體中與小耳畸形相關(guān)的CNV[34,41]Table 3 CNV associated with microtia in all human chromosomes

目前全基因組范圍的分析主要集中在散發(fā)病例與新的拷貝數(shù)變異，策略是用大量無(wú)關(guān)病例-對(duì)照樣本的CNVs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選可能的CNVs后再應(yīng)用生物信息學(xué)分析等手段對(duì)該區(qū)域進(jìn)行候選基因篩選，并用更多的具有相似表型的患者對(duì)這些基因進(jìn)行突變檢測(cè)及表觀遺傳學(xué)研究來(lái)驗(yàn)證?，F(xiàn)今的高通量芯片可以實(shí)現(xiàn)在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)這樣的微缺失，使研究者能鑒定與疾病相關(guān)的染色體位點(diǎn)，通量高且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，因此針對(duì)目標(biāo)區(qū)域的高效和可靠的CNV檢測(cè)是研究小耳畸形的重要手段[43]。全基因組范圍檢測(cè)的策略成本較高，由于當(dāng)前CNVs分析算法還有很大局限性，易出現(xiàn)大量假陽(yáng)性結(jié)果，需要大樣本驗(yàn)證。因此檢測(cè)到的CNV位點(diǎn)還需要經(jīng)過(guò)篩選、去除假陽(yáng)性結(jié)果，然后再通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)（如熒光原位雜交、實(shí)時(shí)定量PCR、質(zhì)譜等）才能確定。需要注意的是，檢測(cè)到的CNV可能只是人群中的多態(tài)現(xiàn)象，與患者表型并無(wú)關(guān)系，因此功能驗(yàn)證是必需的。

4 小鼠基因組信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘

小耳畸形的病因?qū)W研究不僅需要發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的疾病相關(guān)基因，更要揭示基因突變?nèi)绾螀⒓蛹膊“l(fā)生的生物學(xué)機(jī)制。小鼠基因組信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Mouse Genome Informatics,MGI）是由Jackson實(shí)驗(yàn)室主辦的免費(fèi)在線數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)資源庫(kù)，由美國(guó)國(guó)家人類(lèi)基因組研究所（the Na‐tionaal Human Genome Research Institute,NHGRI）、國(guó)家癌癥研究所（National Cancer Insitute,NCI）等機(jī)構(gòu)以促進(jìn)人類(lèi)健康和疾病研究為目的共同組織建立。MGI集成了來(lái)自小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的眾多項(xiàng)目[44]，收集了實(shí)驗(yàn)小鼠的遺傳學(xué)、基因組學(xué)、疾病表型等海量的生物學(xué)數(shù)據(jù)，是為實(shí)驗(yàn)室小鼠創(chuàng)建和定制的數(shù)據(jù)、工具和分析的組合數(shù)據(jù)庫(kù)。利用這一數(shù)據(jù)庫(kù)，研究人員可以相互參考數(shù)據(jù)，及時(shí)共享、更新，這些優(yōu)勢(shì)可以更加便捷的推進(jìn)整體實(shí)驗(yàn)研究。

本文將在小鼠基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)（Mouse Ge‐nome Informatics，MGI,http://www.informatics.jax.org/）中檢索出的與小耳畸形相關(guān)的致病基因進(jìn)行匯總，見(jiàn)表4。

表4 MGI數(shù)據(jù)庫(kù)中與小耳畸形相關(guān)的致病基因。Table 4 Pathogenic genes associated with microtia in MGI database

由于人鼠在分子或基因組水平上高度同源，目前多以小鼠構(gòu)建疾病模型指導(dǎo)人類(lèi)疾病機(jī)制研究。MGI數(shù)據(jù)庫(kù)包含了小鼠基因、蛋白、疾病表型等大量信息，且更新及時(shí)[43]。通過(guò)對(duì)MGI數(shù)據(jù)的分析，可以快速地獲取與小鼠耳部、顱面部發(fā)育相關(guān)的基因，還可以間接地進(jìn)行功能性研究，因此作者認(rèn)為表4中這些功能明確的基因?qū)χ笇?dǎo)人類(lèi)小耳畸形基因的篩選有著重要意義，可以被認(rèn)為是小耳畸形的“優(yōu)先可疑基因”。然而，并非全部致病基因都能被搜索并納入到研究中，MGI數(shù)據(jù)庫(kù)主要是通過(guò)疾病表型分類(lèi)將一類(lèi)基因進(jìn)行匯總，而先天性小耳畸形的表型存在較高異質(zhì)性，分類(lèi)容易混淆。另外，部分研究較少的基因存在信息不準(zhǔn)確的可能。

此外，先天性小耳畸形不僅對(duì)患病兒童造成了巨大的心理負(fù)擔(dān)，也帶給家庭和社會(huì)造成了很大的壓力，因此學(xué)者們?cè)絹?lái)越重視該病的研究，關(guān)于其新的致病基因鑒定結(jié)果將不斷涌現(xiàn)。這就要求研究者們緊密追蹤最新的文獻(xiàn)資料，及時(shí)匯總病因?qū)W研究新進(jìn)展，不斷動(dòng)態(tài)更新小耳畸形的“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”。在對(duì)小耳畸形的不斷研究探索中，研究者們?cè)诎l(fā)現(xiàn)可疑位點(diǎn)的同時(shí)，也更加認(rèn)識(shí)到了該病致病機(jī)制的復(fù)雜性。隨著遺傳學(xué)的飛速發(fā)展以及新技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，目前有多種尋找小耳畸形病因的方法途徑。但要想最科學(xué)合理的實(shí)現(xiàn)研究目的，一方面，研究者們需將多種方法整合成一個(gè)科學(xué)診斷路徑；另一方面，利用目前的鑒定結(jié)果建立一個(gè)“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”，并將檢測(cè)結(jié)果不斷納入、完善該基因庫(kù)，對(duì)就診的小耳畸形患者優(yōu)先考慮這些基因的改變，使小耳畸形的遺傳學(xué)研究更加高效快捷。

本綜述將小耳畸形遺傳學(xué)檢測(cè)的4種途徑（綜合征型小耳畸形調(diào)研、GWAS、CNV檢測(cè)、MGI數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘）組合成為一個(gè)分析路徑，并匯總出先天性小耳畸形的“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”，以方便篩選獲取更加可信、科學(xué)、合理的檢測(cè)結(jié)果。研究者們不僅可以根據(jù)本文中各個(gè)檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)的系統(tǒng)性介紹，在進(jìn)行小耳畸形病因?qū)W探索時(shí)選擇最適合的檢測(cè)方法，還可以利用本文匯總出的“優(yōu)先可疑基因庫(kù)”便捷的篩選可疑致病基因。但本分析路徑只是為廣大專家學(xué)者提供一種研究思路，并非唯一。值得注意的是，由于檢測(cè)原理、樣本選擇、數(shù)據(jù)集合等的多樣性，并不存在所謂的“金標(biāo)準(zhǔn)”可以對(duì)各種檢測(cè)方法獲取的結(jié)果進(jìn)行比較篩選，因此需要對(duì)不同檢測(cè)方法得到的結(jié)果進(jìn)行全面地匯總分析。檢測(cè)到的任何有意義的基因改變均需要通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析，如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型、生物信息學(xué)分析等[45]。隨著分析技術(shù)的不斷完善，研究者們終會(huì)明確該病的遺傳學(xué)機(jī)制，并為其的防治提供理論依據(jù)和指導(dǎo)方向。