劉揆亮 李楠杉 吳 靜* 李文坤 李 倩 王亞丹

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100050; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100038；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院科技處，北京 100730)

結(jié)腸癌(colon cancer，CC)的發(fā)生發(fā)展大多存在一個(gè)特征性的病理變化過(guò)程，即由結(jié)直腸腺瘤起源，沿腺瘤-腺癌序列發(fā)展而來(lái)。深入探討其潛在機(jī)制，尋找有效的診治標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)對(duì)于結(jié)直腸癌的早期診治及預(yù)后改善具有重要意義[1]。筆者前期采用miRNA和LncRNA芯片篩選結(jié)直腸腺瘤-腺癌序列中差異表達(dá)生物標(biāo)志物時(shí)[2-3]，發(fā)現(xiàn)Notchless同源物1(Notchless homolog 1，NLE1) 在結(jié)腸正常黏膜、腺瘤、腺癌組織中的表達(dá)逐步升高，提示其可能在腺瘤-腺癌序列的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用。本研究旨在驗(yàn)證NLE1在結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中的表達(dá)水平，并初步探討其功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

組織芯片為商業(yè)化產(chǎn)品(上海芯超公司，HCol-Ade060CS1-01，HCol-Ade075Pre-01)，共105例結(jié)腸癌[美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC) Ⅰ-Ⅱ期]及癌旁組織標(biāo)本，25例腺瘤[合并高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN)]標(biāo)本。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所用組織標(biāo)本包括25例結(jié)腸癌(AJCC Ⅰ-Ⅱ期)，30例結(jié)腸腺瘤及40例正常對(duì)照組織。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均取得患者知情同意。

1.2 主要試劑

HT29細(xì)胞株(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)；TaqMan PCR試劑盒(Applied Biosystem公司，美國(guó))； GV115慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司)；脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司，美國(guó))；Caspase3/7檢測(cè)試劑盒(G8091,Promege公司，美國(guó))，NLE1兔抗人多克隆抗體(NBP1-83860，Novus公司，美國(guó))；Fas兔抗人多克隆抗體(#2764，CST公司，美國(guó))；Bax兔抗人多克隆抗體(50599-2-Ig ，Proteintech公司，美國(guó))；GAPDH鼠抗人單克隆抗體(sc-32233，Santa Cruz公司，美國(guó))；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(中杉金橋公司)。

1.3 方法

1) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR： NLE1與GAPDH 的引物序列如下：NLE1(F：5′- CCAGGACCGCACCATCAAAG-3′；R：5′-TCGTCGGAGCCAGACACCAG-3′)； GAPDH(F：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；R：5′- CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)值。樣品目的基因表達(dá)水平采用相對(duì)定量的△△Ct方法計(jì)算。

2) 免疫組化：免疫組化染色采用Envision二步法。以鏡下見(jiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性。高倍鏡下(400×)隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察著色強(qiáng)度，染色強(qiáng)度分析：0～3分，0分表達(dá)缺失(無(wú)染色)、1分表達(dá)減弱(淡黃色)、2分中等表達(dá)(黃色)、3分強(qiáng)表達(dá)(黃褐色)；染色細(xì)胞范圍分析：0～3分，0分無(wú)染色細(xì)胞、1分<10%、2分10%～50%、3分>50%。兩個(gè)系統(tǒng)分?jǐn)?shù)相加為總表達(dá)強(qiáng)度，0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。(-)與(+)記入低表達(dá)，(++)與(+++)記入高表達(dá)[4]。

3) 慢病毒的合成及轉(zhuǎn)染： NLE1-shRNA及對(duì)照shRNA序列為：5′-GACAGAGAAGGTCCTAGACAT-3′；5′-GACAGAGAAGGTCCTAGACAT-3′。

構(gòu)建重組載體 pGCSIL-shNLE1 和 pGCSIL-shCtrl，慢病毒顆粒包裝后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)接種到6 孔板后，pGCSIL-shNLE1 慢病毒 或 對(duì)照shRNA慢病毒分別轉(zhuǎn)染HT29細(xì) 胞， 于37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)孵育72 h，PCR及Western blotting方法明確敲除效率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)轉(zhuǎn)染的慢病毒分為shNLE1組與shCtrl組。

4) 增殖與凋亡的檢測(cè)：用慢病毒轉(zhuǎn)染的HT-29 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。增殖檢測(cè)中，在96孔板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(3×103/μL)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d，每日培養(yǎng)終止前4 h加入10 μL噻唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT](5 g/L)，之后加入100 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度490 nm的吸光度值，確定細(xì)胞增殖水平。集落形成試驗(yàn)中，將慢病毒轉(zhuǎn)染的HT-29 細(xì)胞(1×103個(gè)/孔)，接種在6 孔板中并孵育10 d 以形成集落，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基，隨后PBS洗滌細(xì)胞，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定30～60 min，PBS洗滌，Giemsa染液染色后，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)含有>50個(gè)細(xì)胞的菌落總數(shù)，檢測(cè)集落形成數(shù)量。凋亡檢測(cè)中，轉(zhuǎn)染后懸浮細(xì)胞(1×104/mL)于96孔板，培養(yǎng)5 d后，每孔加入100 μL Caspase反應(yīng)液培養(yǎng)，室溫孵育1～2 h后測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度，檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

5) Western blotting檢測(cè)：取相應(yīng)一抗(均為1∶500)，檢測(cè)方法同前[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NLE1在結(jié)腸腺癌及腺瘤組織中的差異表達(dá)

組織芯片中NLE1抗體的免疫組化結(jié)果顯示，在正常結(jié)腸黏膜中偶見(jiàn)上皮細(xì)胞胞核著色；在結(jié)腸腺瘤組織中，可見(jiàn)NLE1表達(dá)增強(qiáng)，以上皮細(xì)胞胞核陽(yáng)性表達(dá)為主；在結(jié)腸腺癌組織中，可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)與胞核陽(yáng)性表達(dá)(圖1A)。在結(jié)腸正常黏膜、腺瘤及腺癌組織中，NLE1的高表達(dá)率分別為14.3% (15/105)，44.0% (11/25)及68.6% (72/105)，腺癌組織中的NLE1表達(dá)水平明顯高于腺瘤及正常黏膜(分別為P<0.05，P<0.01)；腺瘤組織中的NLE1表達(dá)水平明顯高于正常黏膜(P<0.001)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，結(jié)腸正常黏膜、腺瘤及腺癌組織三組的NLE1 mRNA表達(dá)分別為1.38±0.82，5.04±2.09，7.57±1.25。腺癌組織中NLE1表達(dá)水平明顯高于腺瘤及正常黏膜(P<0.05，P<0.01)；腺瘤組織中的NLE1表達(dá)水平明顯高于正常黏膜(P<0.01)(圖1B)。

圖1 結(jié)腸腺瘤-腺癌序列中NLE1的表達(dá)水平

2.2 NLE1對(duì)HT29細(xì)胞增殖凋亡的影響及其可能機(jī)制

應(yīng)用沉默NLE1的慢病毒及對(duì)照轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與shCtrl組相比，shNLE1組的表達(dá)受到明顯抑制，提示沉默有效(圖2A)。轉(zhuǎn)染后96 h及120 h時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，shNLE1組HT-29細(xì)胞增殖水平較shCtrl組顯著降低(P<0.01)(圖2B)，細(xì)胞凋亡水平顯著增高(P<0.05)(圖2C)，集落形成能力也顯著降低(P<0.05)(圖2D)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與shCtrl相比，shNLE1組的HT29細(xì)胞中Fas與Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高(圖3)。

圖2 NLE1沉默抑制HT29細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡

圖3 NLE1沉默顯著促進(jìn)HT29細(xì)胞中Bax與Fas的表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展大多經(jīng)過(guò)腺瘤腺癌序列，在腺瘤及早期腺癌階段，盡早發(fā)現(xiàn)病變，對(duì)于降低結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率具有重要意義[1]。雖然目前早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腺瘤及腺癌仍有賴于腸鏡檢查，但生物標(biāo)志物對(duì)于結(jié)腸癌及癌前病變的早期診斷也具有重要意義。一直以來(lái)，研究人員為尋找理想的胃腸道腫瘤的生物標(biāo)志物進(jìn)行了大量研究，不過(guò)，專門針對(duì)早期胃腸道腫瘤的生物標(biāo)志物的研究較為少見(jiàn)。一項(xiàng)研究[5]針對(duì)早期胃癌、進(jìn)展期胃癌與正常組織進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析，在正常組織與早期胃癌以及早期胃癌與進(jìn)展期胃癌的比較中分別發(fā)現(xiàn)了1 024個(gè)與415個(gè)差異表達(dá)的基因，兩組基因間僅有46個(gè)重疊，提示早期胃腸道腫瘤與進(jìn)展期腫瘤組織中的腫瘤生物標(biāo)志物可能存在差異。有必要針對(duì)早期腫瘤組織進(jìn)行分析以尋找相應(yīng)的生物標(biāo)志物。

本課題組在前期的研究[3]中針對(duì)早期階段結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤及正常組織的各種分子表達(dá)差異進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了一些可能成為新型分子標(biāo)志物的非編碼基因，在前期研究的數(shù)據(jù)中，針對(duì)編碼基因的分析發(fā)現(xiàn),NLE1在結(jié)腸腺瘤及早期階段結(jié)腸癌中的表達(dá)也逐步升高，并存在明顯的表達(dá)差異。提示其可能在結(jié)腸腺瘤及早期結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用。本研究中，筆者首先通過(guò)免疫組化的方法，在包含結(jié)腸腺瘤及腺癌組織的組織芯片中分析了NLE1在結(jié)腸癌組織、腺瘤(高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變)組織及癌旁正常黏膜中的表達(dá)水平的變化，從蛋白層面證實(shí)了NLE1在結(jié)腸腺瘤/腺癌組織中表達(dá)逐漸增強(qiáng)。進(jìn)一步的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)明確了NLE1在mRNA水平上的表達(dá)異常。證實(shí)NLE1在結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中存在高表達(dá)。

有關(guān)NLE1功能的報(bào)道目前并不太多。Notch信號(hào)通路是結(jié)直腸癌中發(fā)揮促癌作用的一條重要通路[6]。NLE1是在尋找Notch通路信號(hào)調(diào)節(jié)劑時(shí)發(fā)現(xiàn)的，其編碼的含WD40重復(fù)序列的蛋白可與Notch受體的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)結(jié)合發(fā)揮作用[7-8]。作為Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑，

NLE1參與了一些重要的生理過(guò)程，尤其是核糖體60S大亞基的生物合成，在小鼠的軸向骨骼形成及兒童期癲癇小發(fā)作中發(fā)揮重要作用[9-10]。近年研究[11]顯示，NLE1還具有維持腸道干細(xì)胞及造血干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。在小鼠腸道上皮內(nèi)條件性敲除NLE1可激活p53，但并不影響Notch通路活性，提示其可能通過(guò)非Notch依賴的通路在腸道穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮作用[11]。有關(guān)NLE1在惡性腫瘤中發(fā)揮何種作用目前報(bào)道不多。新近的一項(xiàng)研究[12]提出，在可自發(fā)出現(xiàn)腸道腫瘤的Apc缺陷小鼠體內(nèi)敲除NLE1后，腫瘤細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，Apc缺陷小鼠的生存有改善，提示NLE1在結(jié)腸癌的發(fā)生中具有促癌作用。本研究中，為初步探索NLE1的功能，筆者采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式，在HT29細(xì)胞中對(duì)NLE1進(jìn)行了表達(dá)沉默，進(jìn)一步的功能檢測(cè)證實(shí)，NLE1沉默可顯著抑制結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的增殖能力，并能夠促進(jìn)其凋亡，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]相符。

NLE1參與促癌作用的機(jī)制目前仍不清楚。筆者的免疫組化染色顯示，NLE1 在結(jié)腸癌組織中同時(shí)存在胞核與胞質(zhì)的異常表達(dá)，而在結(jié)腸腺瘤及正常黏膜中則多為核表達(dá)，提示NLE1在結(jié)腸癌不僅有表達(dá)水平異常，表達(dá)定位也有變化，其確切作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究在沉默NLE1后的HT29細(xì)胞中，通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)了Bax與Fas蛋白表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)二者均有明顯升高，提示在結(jié)腸癌中高表達(dá)的NLE1可能對(duì)這兩種蛋白的表達(dá)有抑制作用。多項(xiàng)研究[14-15]顯示，Bax與Fas均為促凋亡蛋白，多種抗腫瘤藥物可通過(guò)上調(diào)Bax與Fas促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此筆者推測(cè)，結(jié)腸癌組織中高表達(dá)的NLE1有可能通過(guò)Bax與Fas調(diào)控凋亡信號(hào)，影響結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，進(jìn)而發(fā)揮促癌作用。NLE1促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究明確。