程 峰,尚若鋒,楊 珍,梁劍平,郝寶成,王學(xué)紅,郭文柱,劉 宇

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730050)

近年來,消費(fèi)者對(duì)于天然產(chǎn)物的興趣日益增加,精油(EO)作為人工添加劑或藥理學(xué)相關(guān)制劑的替代品,在生物醫(yī)學(xué)、制藥,化妝品、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用得到了極大的普及[1]。截止到目前,研究人員已經(jīng)鑒定了3000多種精油,但是只有300多個(gè)樣品得以應(yīng)用[2]。

茶樹精油(tea tree oil,TTO)是從澳大利亞的桃金娘科互葉白千層的新鮮枝葉中以水蒸餾的方式提取出來的一種無色至淡黃色液體,具有尖銳的樟腦氣味和薄荷醇的清涼感[3],在香料、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)以及化妝品都具有廣泛的應(yīng)用。茶樹精油是由100多種化學(xué)物質(zhì)所組成的混合物,主要是由單萜,倍半萜烯及醇類等所組成[4],具有六種化學(xué)類型,分別是萜品油烯化學(xué)型、松油烯-4-醇化學(xué)型和四種1,8-桉葉素化學(xué)型[5]。由于1,8-桉葉素的副作用較多,在實(shí)際應(yīng)用中多選用松油烯-4-醇化學(xué)型。目前,茶樹精油作為殺菌劑、防腐劑等廣泛的應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域,本文總結(jié)了茶樹精油的抗微生物作用及部分機(jī)理,旨在為茶樹精油在食品保鮮以及醫(yī)藥行業(yè)中“減抗替抗”提供理論依據(jù)。

1 茶樹精油的成分以及含量范圍

茶樹精油的相對(duì)密度為0.885～0.906,微溶于水,可與非極性溶劑混溶。其主要成分是由單萜(對(duì)傘花烴,松油烯-4-醇,萜品油烯,1,8-桉葉素,α-pine烯,γ-萜品烯),倍半萜烯及醇類(單萜醇)等組成,Brophy等[4]開創(chuàng)性的通過氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法檢測了800多個(gè)TTO樣品,并給出了大約100種成分及其濃度范圍。ISO 4730-2017中規(guī)定了松油烯-4-醇化學(xué)型的茶樹精油中的14種特征性組分的含量范圍(表1)[6]。

表1 茶樹精油的主要成分及其含量范圍Table 1 The main contents of TTO

2 茶樹精油的抗菌活性及抗菌作用機(jī)制

2.1 茶樹精油的抗菌活性

茶樹精油具有良好的抗菌活性,澳大利亞新南威爾州北部Bundjalung原住民將茶樹葉子打碎,吸入其碎葉以治療感冒和咳嗽,或者將碎葉撒在傷口上,敷在傷口表面[7]。Penfold[8]最早測定了茶樹精油及其主要成分的抑菌活性并和苯酚的抑菌活性做了對(duì)比。茶樹精油對(duì)一些常見細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)如表2所示。數(shù)據(jù)表明茶樹精油對(duì)大多數(shù)細(xì)菌的MIC值在0.1%以下,并且多數(shù)細(xì)菌的MIC值與MBC值相當(dāng),這說明茶樹精油對(duì)大多數(shù)細(xì)菌起殺菌作用,但對(duì)于部分細(xì)菌在低濃度情況下只起抑菌作用。

表2 部分細(xì)菌對(duì)茶樹精油的藥敏數(shù)據(jù)Table 2 The susceptibility data for bacteria tested to TTO

近年來,隨著細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重,植物精油由于其獨(dú)抗菌譜廣、毒副作用小而進(jìn)入了研究人員的視野,Walsh[18]首先提出茶樹精油具有殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的潛力,和化學(xué)藥物相比,茶樹精油的成分更為復(fù)雜;Carson[19]通過實(shí)驗(yàn)證明了茶樹精油及其主要成分松油烯-4-醇不會(huì)影響細(xì)菌的耐藥性以及不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生新的耐藥性[20],在延緩抗生素耐藥性的發(fā)展具有良好的應(yīng)用前景。同時(shí),茶樹精油作為一種廣譜、低毒、性能優(yōu)異并具有一定芳香氣味的抗菌劑,對(duì)于控制醫(yī)院獲得性感染和在家庭衛(wèi)生消毒中具有很好的應(yīng)用前景。

2.2 茶樹精油的抗菌作用機(jī)制

從茶樹精油大部分成分的親脂性中可以推測出茶樹精油的抗菌機(jī)理可能是破壞細(xì)胞膜的生物功能,而Cox等[21]的茶樹精油可以滲透脂質(zhì)體系統(tǒng)的數(shù)據(jù)也支持這個(gè)觀點(diǎn)。目前大多數(shù)研究也都集中在茶樹精油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的影響上,具體表現(xiàn)為在形態(tài)學(xué)上,細(xì)菌細(xì)胞膜以及生物膜被破壞[22],在功能上表現(xiàn)為鉀離子外流[23],碘化丙啶(PI)攝入增加[24],培養(yǎng)液中可溶性蛋白含量增加[24],DNA、RNA以及其它大分子物質(zhì)的滲出[25]。Ce等[26]發(fā)現(xiàn)暴露于茶樹精油的單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌的細(xì)胞膜發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷,使用碘化丙啶染色后發(fā)現(xiàn)暴露于茶樹精油的細(xì)菌的細(xì)胞膜損傷可以達(dá)到95%以上,同時(shí)鉀離子的外流增加也抑制了細(xì)菌的呼吸作用,進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)菌的死亡。掃描電鏡拍照也觀察到了大腸桿菌菌體的溶解與對(duì)細(xì)胞表面電子致密物質(zhì)的破壞[22]。以上結(jié)果均證明了茶樹精油通過破壞細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。

細(xì)菌生物被膜(BF)是一種自我合成、表面附著的細(xì)胞群[27],可以顯著增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性并促進(jìn)其逃脫機(jī)體免疫。茶樹精油可以有效破壞金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的生物膜,通過激光共聚焦顯微鏡可清晰觀察到所引起的生物膜損傷[12]。松油烯-4-醇處理后的金黃色葡萄球菌也可發(fā)生類似的生物膜損傷現(xiàn)象。多糖胞間粘附素(PIA)是細(xì)菌形成生物膜的關(guān)鍵物質(zhì)之一[28],相關(guān)研究指出,金黃色葡萄球菌經(jīng)茶樹精油處理后,SarA和icaADBC基因均顯著下調(diào)[12],SarA基因可以促進(jìn)icaADBC基因的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)PIA的形成;同時(shí),與絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑相關(guān)的11個(gè)基因的表達(dá)也顯著上調(diào),絲氨酸與蘇氨酸的代謝可以產(chǎn)生更多的纖溶蛋白,從而防止細(xì)菌粘附在表面,破壞生物膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)菌釋放及死亡。以上研究表明茶樹精油可以通過破壞細(xì)菌的生物膜起到殺菌作用。

茶樹精油對(duì)細(xì)菌毒素也有一定的影響,Liu等[29]發(fā)現(xiàn)茶樹精油可以抑制李斯特桿菌的毒素,并進(jìn)一步驗(yàn)證了茶樹精油通過抑制李斯特桿菌溶血素O(LLO)的p60蛋白的分泌和相關(guān)基因Hly以及IAP的表達(dá),并有效抑制李斯特菌刺激的巨噬細(xì)胞激活的NLRP3炎癥途徑蛋白的表達(dá)。

茶樹精油可以通過多種方式抑制以及殺滅細(xì)菌,并對(duì)生物膜中和浮游的細(xì)菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性,可以有效地降低細(xì)菌耐藥性的發(fā)展。目前對(duì)其作用機(jī)制的研究還不是特別透徹,尤其是茶樹精油中各種單體的作用以及它們之間的相互作用仍需要進(jìn)一步的深入研究。

3 茶樹精油的抗真菌活性及其作用機(jī)制

3.1 茶樹精油的抗真菌活性

茶樹精油具有良好的抗真菌活性,并且在陰道念珠菌的治療[30]和果蔬保鮮[31]方面有廣泛的應(yīng)用。有研究數(shù)據(jù)表明茶樹精油對(duì)酵母菌[32]和某些絲狀真菌[33]較為敏感,從表3可以看出,茶樹精油對(duì)大多數(shù)真菌的MIC(最小抑真菌濃度)值在0.12%～0.2%之間。Oliva等[34]測定了茶樹精油、5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的抗真菌活性,發(fā)現(xiàn)茶樹精油的抗真菌活性在一定程度上優(yōu)于其他兩種。但是這些研究都是集中在對(duì)化學(xué)試劑不敏感的分生孢子上,Hammer[32]比較了萌發(fā)前后的黑曲霉分生孢子對(duì)茶樹精油敏感性,發(fā)現(xiàn)萌發(fā)的比未萌發(fā)的更敏感。這一結(jié)果表明,完整的分生孢子壁對(duì)真菌有強(qiáng)大的保護(hù)作用。Rocha等[35]證明0.25%的茶樹精油水蒸氣也能明顯的抑制擴(kuò)張青霉分生孢子的萌發(fā)。

表3 部分真菌對(duì)茶樹精油的藥敏數(shù)據(jù)Table 3 The susceptibility data for fungal tested to TTO

3.2 茶樹精油的抗真菌作用機(jī)制

3.2.1 茶樹精油對(duì)真菌細(xì)胞膜的破壞 茶樹精油對(duì)真菌作用機(jī)制與細(xì)菌相類似,也是通過改變真菌細(xì)胞膜的通透性進(jìn)而起到對(duì)真菌的抑制作用。Hammer等[38]用0.016%～0.06%(v/v)茶樹精油培養(yǎng)白色念珠菌24 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜的流動(dòng)性明顯增加;Zhang等[39]發(fā)現(xiàn)的茶樹精油可以促進(jìn)抗生素譬如氟康唑向胞內(nèi)擴(kuò)散,從而產(chǎn)生強(qiáng)大的協(xié)同效應(yīng),可見茶樹精油通過改變膜特性和損害細(xì)胞膜相關(guān)功能發(fā)揮其抗真菌作用。

3.2.2 茶樹精油對(duì)真菌芽管形成的抑制 茶樹精油可以抑制真菌在生殖活動(dòng)中芽管或菌絲轉(zhuǎn)換體的形成。Hammer[38]和D’Auria[40]等研究發(fā)現(xiàn)在0.25%和0.125%茶樹精油的存在下,胚芽管形成被完全抑制,同時(shí)還觀察到芽孢子從單芽或單芽形態(tài)變?yōu)槎嗵バ螒B(tài)的趨勢。此外,去除茶樹精油后真菌能夠重新形成胚芽管,表明了茶樹精油對(duì)真菌生殖管的抑制是可逆的。

3.2.3 茶樹精油對(duì)真菌呼吸的抑制 茶樹精油還可以抑制真菌的呼吸作用。Cox等[41]發(fā)現(xiàn)茶樹精油的濃度在0.125%時(shí)即可顯著的抑制白色念珠菌的呼吸作用。在濃度為1.0%、0.5%時(shí)對(duì)白色念珠菌的抑制作用分別為95%、40%。Hammer[38]等還發(fā)現(xiàn)茶樹精油可以抑制白色念珠菌,光滑念珠菌和釀酒酵母的葡萄糖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基酸化,而培養(yǎng)基酸化的原因可能是通過質(zhì)膜ATP泵所產(chǎn)生的。可見茶樹精油可以通過抑制真菌的能量代謝過程和破壞線粒體膜的完整性而起到殺真菌作用。

Li等[31]的研究發(fā)現(xiàn),茶樹精油可以導(dǎo)致灰葡萄孢線粒體膜的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,增加線粒體膜的通透性,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP的含量下降,細(xì)胞外ATP含量增加;并且增加茶樹精油的濃度進(jìn)一步影響與三羧酸循環(huán)有關(guān)酶的活性,使檸檬酸合成酶、檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和ATP酶的活性降低,同時(shí)大大增加了活性氧(ROS)的水平,從而破壞了三羧酸循環(huán),最終導(dǎo)致菌體的死亡。Xu[42]用等壓標(biāo)記進(jìn)行相對(duì)和絕對(duì)定量的方法,在茶樹精油處理與未處理的灰霉病菌中發(fā)現(xiàn)了718個(gè)差異表達(dá)蛋白(DEP),其中17個(gè)顯著上調(diào),701個(gè)顯著下調(diào)。其中約78%與糖酵解、三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))和嘌呤代謝有關(guān),這些都表明了茶樹精油可能是通過抑制真菌的三羧酸循環(huán)來殺滅或者抑制真菌生長。

茶樹精油具有強(qiáng)大的抗真菌作用,對(duì)霉菌、酵母以及鐮刀菌屬均有明顯的抑制作用,說明茶樹精油在食物保鮮以及人類皮膚病的防治上具有良好的應(yīng)用前景,并且茶樹精油對(duì)真菌作用的靶點(diǎn)的多樣,對(duì)其細(xì)胞膜、生殖作用、呼吸作用具有顯著的影響,降低了產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn),但其對(duì)于真菌的芽管的作用的機(jī)制以及各個(gè)組分之間的相互作用的研究還不夠透徹,需要進(jìn)一步的深入研究。

4 茶樹精油的抗病毒活性

茶樹精油具有一定的抗病毒活性,Bishop等[42]首先報(bào)道了茶樹精油具有抗煙草花葉病毒的活性,還有研究指出茶樹精油對(duì)單純皰疹病毒Ⅰ[43]、流感病毒[44]、人類乳頭狀瘤病毒[45]、腺病毒2型[46]、痘病毒[47]有很好的殺滅作用。但對(duì)于其殺滅機(jī)理的研究較少。Schnitzler等[48]用茶樹精油處理處于不同復(fù)制周期的病毒發(fā)現(xiàn)茶樹精油對(duì)游離病毒的殺滅效果最好。Garozzo等[48]發(fā)現(xiàn)在流感病毒吸附后1 h內(nèi)用茶樹油處理會(huì)造成活病毒數(shù)量的大量減少,但是2 h以后用茶樹精油對(duì)病毒的活性基本沒有影響,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)茶樹精油可以通過干擾抑制病毒脫殼的溶酶體內(nèi)腔室酸化來抑制流感病毒在細(xì)胞中的生長,內(nèi)泌體和溶酶體的酸性條件可以引起病毒包膜融合活動(dòng),包膜融合對(duì)流感病毒感染的脫殼過程至關(guān)重要,可見,茶樹精油是干擾了病毒復(fù)制的早期階段。雖然茶樹精油具有一定的抗病毒效果,但迄今為止測試的病毒范圍非常有限,缺乏大量的體外和臨床數(shù)據(jù)證明其存在廣譜的抗病毒效果。

5 茶樹精油的抗寄生蟲活性

6 茶樹精油的有效作用成分

茶樹精油的RW[8]系數(shù)表明,其主要活性成分可能是松油烯-4-醇和α-萜品醇,有大量的數(shù)據(jù)顯示這兩種成分對(duì)微生物的生長具有一定的抑制作用,但由于α-萜品醇在茶樹精油中的含量較低,研究人員普遍認(rèn)為松油烯-4-醇是茶樹精油的最主要的活性成分。Cox等[41]發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇和γ-萜品烯或和癸烯的組合產(chǎn)生與茶樹精油近的抑菌活性,但是γ-萜品烯和癸烯卻降低了松油烯-4-醇的水溶性;Li等[53]發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌以及黑曲霉菌的抑制活性與茶樹精油相當(dāng),可以推測松油烯-4-醇的抑菌活性和茶樹精油相當(dāng)甚至更加強(qiáng)大。

但近期有研究表示松油烯-4-醇可能不是茶樹精油的主要活性成分。Paola Brun等[14]研究了10種市售的茶樹精油產(chǎn)品的抗微生物活性和化學(xué)特征,通過GC-MS發(fā)現(xiàn)盡管10種產(chǎn)品都屬于松油烯-4-醇型茶樹精油,并且九種主要化學(xué)成分的含量都符合ISO的規(guī)定,但是它們每種成分的具體含量還有較大的差別。它們分別測定了這10種精油對(duì)光滑念珠菌、單純皰疹病毒1型(HSV-1)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和銅綠假單胞菌評(píng)估抗菌活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有5種精油產(chǎn)生了較為明顯的抗微生物作用,并且在這5種精油中抗微生物活性最好的是含有較低含量的松油烯-4-醇和較高的α-萜品醇、α-品烯和1,8-桉葉素,松油烯-4-醇含量最高的茶樹精油的抗微生物活性反而最低。通過數(shù)據(jù)分析無法確認(rèn)茶樹精油某一成分的含量與其抗微生物活性之間有明確的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果說明了松油烯-4-醇可能不是茶樹精油抗菌活性的全部來源,其抗微生物活性可能是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果。正是由于茶樹精油成分的多樣性,其中各個(gè)組份抗微生物的機(jī)理也不盡相同,因此很難將其生物活性歸于其中復(fù)雜化合物中的單一化合物,可以將其抗微生物效果視為包括每種微量成分在內(nèi)的多種化合物之間的協(xié)同作用,但是這種協(xié)同作用需要進(jìn)一步深入研究。

7 結(jié)語

隨著抗生素濫用所帶來的細(xì)菌耐藥性問題的不斷惡化,諸如茶樹精油之類的天然替抗產(chǎn)品越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前,茶樹精油已被應(yīng)用于治療和預(yù)防某些微生物感染,并且由于其毒副作用小,受到了研究人員的普遍青睞,但目前仍缺乏針對(duì)微生物感染治療的臨床證據(jù),因此,需要進(jìn)一步通過大規(guī)模臨床研究來鞏固茶樹精油在替抗領(lǐng)域的用藥地位。

茶樹精油含有多種化學(xué)成分,其抗微生物機(jī)理也較為復(fù)雜,目前大部分研究也都集中在茶樹精油對(duì)微生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和線粒體膜的破壞以及對(duì)能量代謝、生殖活動(dòng)的影響上,但各個(gè)藥物組分之間的相互作用并不明確,仍需進(jìn)一步深入探索。

近年來隨著系統(tǒng)生物學(xué)以及計(jì)算機(jī)模擬的天然產(chǎn)物靶標(biāo)預(yù)測技術(shù)的飛速發(fā)展,可通過基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)等技術(shù)研究茶樹精油抗微生物的作用機(jī)制。同時(shí),結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬的天然產(chǎn)物靶標(biāo)預(yù)測技術(shù)和生物信息學(xué)等方法,對(duì)揭示茶樹精油對(duì)于微生物某個(gè)靶點(diǎn)的作用乃至整個(gè)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的影響和在“減抗替抗”中的應(yīng)用具有重要意義。