許 磊,焦思明,張文昌,程 功,孫家言,趙 巖,*,張勁松,*

(1.中國(guó)科學(xué)院金屬研究所沈陽(yáng)材料科學(xué)國(guó)家研究中心,遼寧沈陽(yáng) 110016; 2.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

低分子量殼聚糖(low molecular weight chitosan)和殼寡糖(chitooligosaccharides,COS)是一類具有抗菌[1-2]、調(diào)節(jié)免疫[3-4]、抗腫瘤[5-6]、誘導(dǎo)植物抗病抗逆與促進(jìn)植物生長(zhǎng)[7-8]等多種生物活性的生物材料[9-11],通常由殼聚糖(chitosan,CS)降解制備,具有良好的應(yīng)用前景。目前較低的生產(chǎn)效率和制備成本限制了它們的廣泛應(yīng)用。殼聚糖的降解通常包括氧化降解、酶降解和酸降解等方法[12-13]。殼聚糖氧化降解中較為常用的氧化劑是過(guò)氧化氫[14-15],但其降解產(chǎn)物的糖單元的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化[16]。酶降解是一種較為常用的殼聚糖降解方法,通常將殼聚糖用稀酸溶解后添加適量的酶進(jìn)行降解反應(yīng)[17-19]。殼聚糖本身是一種高分子,溶解后會(huì)產(chǎn)生一定的粘度,其粘度隨著濃度的增大而增大。當(dāng)殼聚糖溶液粘度過(guò)大時(shí),酶降解難以順利進(jìn)行,因此酶降解反應(yīng)殼聚糖底物的濃度通常為2.0%(2.5%左右,限制了殼寡糖單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)能。

酸降解也是一種較為常用的殼聚糖降解方法,一般是將殼聚糖用稀酸溶解后,以“勻相”的方式進(jìn)行降解[20-21],目前存在收率低,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)和廢液排放等問(wèn)題。Osorio-Madrazo研究了殼聚糖在固相條件下進(jìn)行酸降解[22-23],與殼聚糖“勻相”酸降解相比,固相酸降解具有反應(yīng)時(shí)間短、后處理簡(jiǎn)單、降低廢液排放等優(yōu)點(diǎn),但由于常規(guī)加熱方法難以實(shí)現(xiàn)對(duì)固相反應(yīng)體系的快速均勻加熱,使得殼聚糖的固相降解反應(yīng)過(guò)程難以控制。

微波是一種電磁波,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)材料的選擇性加熱,強(qiáng)化化學(xué)反應(yīng)過(guò)程,大幅提高反應(yīng)速率。微波降解殼聚糖已有研究,Jaroslaw認(rèn)為微波提高降解反應(yīng)速率的機(jī)理是微波引起分子振蕩產(chǎn)生剪切力導(dǎo)致聚合物主鏈斷裂[24],Chen和Xing在研究殼聚糖微波降解時(shí)使用離子液體[25]、無(wú)機(jī)鹽[26]等作為添加劑,他們認(rèn)為微波提高降解反應(yīng)速率的機(jī)理是微波與添加劑的相互作用產(chǎn)生過(guò)熱效應(yīng)。微波加熱酶降解殼聚糖制備殼寡糖的研究[27-28]也有相關(guān)報(bào)道。這些方法均是以“勻相”方式進(jìn)行,殼聚糖在微波強(qiáng)化下的固相酸降解還未有報(bào)道。

針對(duì)常規(guī)加熱方法殼聚糖固相酸降解過(guò)程中物料難以快速均勻加熱的問(wèn)題,本文研究了微波強(qiáng)化下的殼聚糖固相酸降解反應(yīng)。利用微波對(duì)材料的選擇性加熱特點(diǎn),開發(fā)出一種高效制備低分子量殼聚糖和殼寡糖的方法,有助于低分子量殼聚糖和殼寡糖的廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 脫乙酰度=85%,揚(yáng)州日興生物科技有限公司;殼聚糖酶APCSN(酶活力:2500 U/g) 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所提供;系列分子量右旋糖酐(峰位分子量Mp=180、9750、36800、135350、300600、2000000) 中國(guó)食品藥品檢定研究所;其他試劑 均為AR級(jí)。

微波反應(yīng)器 實(shí)驗(yàn)室自制,其示意圖見圖1,反應(yīng)釜外壁為不銹鋼,內(nèi)襯為聚四氟乙烯,微波發(fā)射頻率為2450 Hz;LC-20A高效液相色譜儀(配有LC-20AT恒流泵、CTO-20A柱溫箱、RID-10A示差檢測(cè)器) 日本Shimadzu公司;Agilent Technologies Cary 630 spectrometer傅立葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Agilent公司;Bruker 600 MHz UltraShieldTM核磁共振儀 瑞士Bruker公司;TSQ Quantum Access Max質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Scientific公司;NDG-5型數(shù)顯粘度計(jì) 上海順宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

圖1 微波反應(yīng)器示意圖Fig.1 Schematic diagram of microwave reactor

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反應(yīng)參數(shù)對(duì)微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解的影響

1.2.1.1 微波輻射功率 稱取30 g殼聚糖置于微波反應(yīng)器的反應(yīng)釜中,緩慢加入15 mL 12 mol/L鹽酸,攪拌均勻后物料用微波加熱。微波輻射功率分別為10、20、30、40、50 W,輻照時(shí)間為4 min。反應(yīng)結(jié)束后,物料用無(wú)水乙醇洗滌兩次,4000 r/min離心5 min,60 ℃真空干燥24 h,得到降解產(chǎn)物(總共5組反應(yīng),得到5份降解產(chǎn)物,分別編號(hào)為W10、W20、W30、W40、W50)。

1.2.1.2 鹽酸用量 稱取30 g殼聚糖置于微波反應(yīng)器反應(yīng)釜中,緩慢加入不同劑量的12 mol/L鹽酸(分別為12、15、18 mL,即殼聚糖/鹽酸的質(zhì)量體積比為5∶2、2∶1、5∶3),攪拌均勻后物料用微波加熱。微波輻射功率為20 W,輻射時(shí)間依次為4、7、10、15、20 min。反應(yīng)結(jié)束后,物料用無(wú)水乙醇洗滌兩次,4000 r/min離心5 min,60 ℃真空干燥24 h,得到降解產(chǎn)物(總共15組反應(yīng),得到15份降解產(chǎn)物,分別編號(hào)為CS12-4～CS12-20、CS15-4～CS15-20、CS18-4～CS18-20)。

1.2.2 降解產(chǎn)物的GPC(凝膠滲透色譜)分析 稱取上述制備的降解產(chǎn)物各10 mg,用1 mL 0.1 moL/L的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液溶解,配成10 mg/mL的溶液,用GPC分析分子量數(shù)據(jù)。GPC的色譜條件為:A6000M色譜柱(300 mm×8.0 mm,Viscotek),柱溫30 ℃,流動(dòng)相為0.1 moL/L的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,標(biāo)定色譜柱分子量的標(biāo)準(zhǔn)品是系列分子量的右旋糖酐。

1.2.3 降解產(chǎn)物的FTIR(傅立葉變換紅外光譜)和1H NMR(核磁共振氫譜)分析 稱取上述制備的部分降解產(chǎn)物(CS15-4～CS15-20)與干燥的KBr以1∶100的質(zhì)量比混合,壓片后進(jìn)行FTIR分析。FTIR波數(shù)范圍為400～4000 cm-1,分辨率為4 cm-1,在透射模式下累積128次掃描。另取上述制備的部分降解產(chǎn)物(CS15-4～CS15-20)各30 mg,加入0.5 mL D2O溶解,進(jìn)行1H NMR分析。

1.2.4 降解產(chǎn)物的粘度系數(shù)測(cè)定 稱取上述制備的部分降解產(chǎn)物(CS15-4～CS15-20)各5 g,配制成濃度為10%的水溶液,用轉(zhuǎn)子粘度計(jì)在室溫下測(cè)定粘度系數(shù)。

1.2.5 微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解和酶降解復(fù)合制備殼寡糖 按照上述優(yōu)化得到的最優(yōu)參數(shù)制備殼寡糖,即稱取30 g殼聚糖,置于微波反應(yīng)器的反應(yīng)釜中,然后緩慢加入15 mL 12 mol/L的鹽酸,充分?jǐn)嚢杌旌虾?微波加熱,微波功率20 W,微波輻射時(shí)間20 min。反應(yīng)結(jié)束后,取出物料加入蒸餾水配置成濃度約為10%的溶液,加入一定量的殼聚糖原料調(diào)節(jié)溶液的pH至5.0左右。最后溶液中加入300 mg的殼聚糖酶APCSN,42 ℃酶降解24 h,4000 r/min離心5 min,清液部分冷凍干燥,得到殼寡糖。

1.2.6 殼寡糖的MS(質(zhì)譜)和1H NMR分析 稱取殼寡糖凍干樣品10 mg,使用超純水配制成0.2 mg/mL溶液,使用MS直接進(jìn)樣檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)條件為:ESI 源,正離子掃描模式,毛細(xì)管電壓為3 kV,錐孔電壓為60 V,離子源溫度為150 ℃,脫溶劑氣的溫度為500 ℃,錐孔氣流量為50 L/h,脫溶劑氣流量為800 L/h,碰撞能量為30～60 V,離子能量為3 V。另取殼寡糖凍干樣品30 mg,加入0.5 mL D2O溶解,進(jìn)行1H NMR測(cè)試。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GPC采用LC-solution軟件處理數(shù)據(jù),MS采用Thermo TSQ Quantum軟件處理數(shù)據(jù),Origin 6.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)參數(shù)對(duì)微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解的影響

2.1.1 微波輻射功率 首先研究微波輻射功率對(duì)微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解的影響,表1給出了不同微波輻射功率降解產(chǎn)物的GPC數(shù)據(jù)(Mn和Mw分別表示數(shù)均分子量和重均分子量)。根據(jù)GPC分析可知,微波功率越大,其降解產(chǎn)物的分子量越小,即殼聚糖的降解反應(yīng)、速率隨微波功率的增加而加快,其原因在于體系溫度是決定降解反應(yīng)速率的主要因素之一。微波功率越大,體系升溫越快,殼聚糖的降解速率越快，當(dāng)微波功率為20 W時(shí),殼聚糖的降解速率適中,因此固定微波功率為20 W。

表1 不同微波輻射功率降解產(chǎn)物的GPC數(shù)據(jù)Table 1 GPC analysis of degraded products by microwave irradiation with different power

2.1.2 鹽酸用量 繼續(xù)研究鹽酸用量對(duì)微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解的影響。表2給出了不同鹽酸用量制備的降解產(chǎn)物的GPC數(shù)據(jù)。圖2為殼聚糖(CS)和部分降解產(chǎn)物的GPC洗脫曲線,與殼聚糖CS相比,降解產(chǎn)物CS12-10、CS15-10和CS18-10的保留時(shí)間(Retention time)均有所加長(zhǎng),說(shuō)明降解反應(yīng)進(jìn)行10 min后,降解產(chǎn)物的平均分子量均已降低,其中降解產(chǎn)物CS15-10和CS18-10的平均分子量降低更為明顯。圖3為不同鹽酸用量制備的降解產(chǎn)物的Mw的變化曲線,說(shuō)明隨著降解反應(yīng)的進(jìn)行,降解產(chǎn)物的分子量逐漸下降,鹽酸用量為12 mL的殼聚糖降解速率相對(duì)較慢,而鹽酸用量為15和18 mL的殼聚糖降解速率相對(duì)更快。

表2 不同鹽酸用量降解產(chǎn)物的GPC數(shù)據(jù)Table 2 GPC analysis of degraded products by microwave irradiation with dosage of hydrochloric acid

圖2 殼聚糖(CS)和降解產(chǎn)物(CS12-10、 CS15-10、CS18-10)的GPC洗脫曲線Fig.2 GPC elution curve of chitosan(CS)and degraded products(CS12-10,CS15-10,CS18-10)

圖3 不同鹽酸用量降解產(chǎn)物的Mw的變化曲線Fig.3 Change curve of MW of degraded products with dosage of hydrochloric acid

殼聚糖酸降解反應(yīng),除了體系溫度,[H]+的濃度也是決定降解反應(yīng)速率的主要因素之一。微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解過(guò)程中,殼聚糖首先與鹽酸進(jìn)行成鹽反應(yīng)生成鹽酸鹽,消耗一定量的[H]+,剩余的[H]+則作為催化劑參與反應(yīng),其濃度越高,殼聚糖降解速率越快。GPC數(shù)據(jù)分析、圖2和圖3表明,鹽酸用量為12 mL的殼聚糖降解速率相對(duì)較慢,其主要原因是大部分[H]+與殼聚糖反應(yīng)生成鹽酸鹽,起催化作用的[H]+濃度相對(duì)較低。鹽酸用量為15和18 mL的殼聚糖降解速率較快,主要原因是起催化作用的[H]+濃度相對(duì)較高,經(jīng)微波輻射15 min以上,其降解產(chǎn)物(CS15-15、CS15-20、CS18-15、CS18-20)的重均分子量均小于50000,已達(dá)到低分子量殼聚糖的水平。在微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解反應(yīng)能夠順利進(jìn)行的基礎(chǔ)上,從環(huán)保方面考慮應(yīng)降低鹽酸的使用量,因此最佳降解工藝的鹽酸用量為15 mL,即殼聚糖/鹽酸的質(zhì)量體積比為2∶1。

2.2 微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

殼聚糖(CS)和降解產(chǎn)物(CS15-4～CS15-20)的FTIR光譜見圖4。FTIR光譜表明,微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解反應(yīng)過(guò)程中,殼聚糖在不同的降解時(shí)間內(nèi)其結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。隨著降解反應(yīng)的進(jìn)行,A1150/A1050(A1150和A1050分別代表樣品在FTIR光譜中波數(shù)為1150和1050 cm-1對(duì)應(yīng)的吸收度,A1150/A1050即兩者的比值)數(shù)值不斷降低,表明殼聚糖單體間的糖苷鍵在酸降解過(guò)程中不斷減少[29]。

降解產(chǎn)物(CS15-4～CS15-20)的脫乙酰度用1H NMR法測(cè)定[30],數(shù)據(jù)見表3。通過(guò)分析可知,與殼聚糖原料相比,降解產(chǎn)物的脫乙酰度略有增加,說(shuō)明微波強(qiáng)化固相酸降解反應(yīng)中,殼聚糖上的N-乙酰氨基會(huì)發(fā)生少量的脫乙酰反應(yīng)。

經(jīng)FTIR和1H NMR分析,表明微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解反應(yīng)中,殼聚糖沿主鏈隨機(jī)降解,N-乙酰氨基會(huì)發(fā)生少量的脫乙酰反應(yīng),除此之外未觀察到其它結(jié)構(gòu)變化。殼聚糖微波固相酸降解過(guò)程中,由于殼聚糖能與鹽酸進(jìn)行成鹽反應(yīng),因此降解產(chǎn)物主要以鹽酸鹽的形式存在,具有良好的水溶性。

2.3 微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解和酶降解復(fù)合制備殼寡糖

經(jīng)過(guò)上述的相關(guān)研究可知,采用微波強(qiáng)化固相酸降解的方法,殼聚糖可在短時(shí)間內(nèi)快速均勻降解,得到重均分子量低于50000且具有良好水溶性的低分子量殼聚糖。但是,當(dāng)繼續(xù)加大鹽酸用量或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,制備平均分子量更低的殼聚糖(重均分子量低于10000)或殼寡糖時(shí),產(chǎn)品的收率就會(huì)明顯下降且狀態(tài)變差,其主要原因在于酸降解過(guò)程中糖苷鍵的斷裂是隨機(jī)發(fā)生的,隨著降解反應(yīng)的進(jìn)行會(huì)不斷地產(chǎn)生大量的單糖,而單糖在酸性的條件下會(huì)發(fā)生多種副反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)品狀態(tài)差和收率降低,甚至生成毒性物質(zhì)[31]。

殼聚糖經(jīng)微波強(qiáng)化固相酸降解處理后,由于其平均分子量已明顯降低,溶解后的粘度也將大幅降低。降解產(chǎn)物(CS15-4(CS15-20)的粘度系數(shù)數(shù)據(jù)見表4。根據(jù)表4可知,降解產(chǎn)物CS15-10、CS15-15和CS15-20的溶液濃度為10%時(shí),其粘度系數(shù)均低于殼聚糖原料(濃度2.5%)。使用經(jīng)微波強(qiáng)化固相酸降解處理后的低分子量殼聚糖作為酶降解的底物,底物的濃度可大幅提高,從而提高酶降解制備殼寡糖單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)能。因此,當(dāng)降解目標(biāo)產(chǎn)物是重均分子量低于10000的殼聚糖(例如殼寡糖)時(shí),可先采用微波固相強(qiáng)化酸降解制備低分子量殼聚糖(重均分子量10000～50000),然后得到的低分子量殼聚糖再用酶降解制備殼寡糖。這種復(fù)合降解方法即能避免酸降解收率低狀態(tài)差的問(wèn)題,又可改善酶降解的制備效率,提高殼寡糖單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)能。

表4 殼聚糖和降解產(chǎn)物的粘度系數(shù)Table 4 Viscosity coefficient of chitosan and degraded products

考慮到整個(gè)方法的連續(xù)性和便捷性,復(fù)合降解最佳工藝為微波強(qiáng)化固相酸降解反應(yīng)完成后,得到的低分子量殼聚糖直接溶解進(jìn)行酶降解,即物料不經(jīng)過(guò)醇洗、干燥等處理過(guò)程。由于微波固相酸降解中[H]+是過(guò)量的,因此溶解后溶液的pH可能會(huì)過(guò)低,影響酶解的效率,可通過(guò)添加適量的殼聚糖原料來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH至酶降解適合的區(qū)間(殼聚糖酶APCSN為4.2～6.0),從而使酶降解反應(yīng)順利進(jìn)行。

以降解產(chǎn)物CS15-20(降解產(chǎn)物CS15-10,CS15-15經(jīng)調(diào)節(jié)pH處理后,其粘度系數(shù)均大于972.5 cm·g·s)的微波強(qiáng)化固相酸降解反應(yīng)條件,研究微波強(qiáng)化固相酸降解和酶降解復(fù)合制備殼寡糖。微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解反應(yīng)結(jié)束后,取出物料直接加入蒸餾水配置成濃度約為10%的溶液,測(cè)定溶液的pH為1.4左右。向溶液中添加殼聚糖原料(約4.5 g),待其完全溶解后溶液,測(cè)定溶液的pH為5.0左右(處于殼聚糖酶APCSN降解的適合區(qū)間),此時(shí)溶液的粘度系數(shù)為524 cm·g·s(仍低于2.5%的殼聚糖溶液,說(shuō)明在粘度上酶降解反應(yīng)可以順利進(jìn)行)。最后添加殼聚糖酶APCSN進(jìn)行酶降解反應(yīng),得到殼寡糖COS。這種復(fù)合降解最后酶降解時(shí)殼聚糖底物的濃度可達(dá)11.5%,是目前酶降解法制備殼寡糖生產(chǎn)工藝中殼聚糖底物濃度(2.0%～2.5%)的4倍以上,即殼寡糖單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)能可提高4倍以上。

最后用MS和1H NMR對(duì)制備的殼寡糖COS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。

MS檢測(cè)(圖5)及分析結(jié)果顯示,殼寡糖COS的主要成分為全脫乙酰的殼二糖至殼五糖,此外還含有少量的含乙?；臍す烟墙M分。圖6為殼寡糖COS的1H NMR譜圖,為典型的殼寡糖1H NMR譜圖,殼寡糖的脫乙酰度為88%。

圖5 殼寡糖COS的MS分析 Fig.5 Mass spectrometry analysis of chitooligosaccharides COS

圖6 殼寡糖COS的1H-NMRFig.6 1H-NMR of chitooligosaccharides COS

MS和1H NMR的分析表明,殼寡糖COS的主要組成成分與殼聚糖直接酶降解制備的殼寡糖(中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所提供,殼聚糖用稀鹽酸溶解后酶降解,濃度為2.5%,酶的種類和反應(yīng)條件與本文完全相同)的結(jié)構(gòu)基本完全一致,說(shuō)明微波強(qiáng)化固相酸降解和酶降解復(fù)合制備殼寡糖完全具有可行性,可以顯著提高殼寡糖單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)能。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于微波強(qiáng)化固相酸降解的高效制備低分子量殼聚糖的方法。利用微波對(duì)酸化物料的選擇性加熱特點(diǎn),有效解決了常規(guī)加熱方式殼聚糖固相酸降解過(guò)程中物料的快速均勻加熱難題。殼聚糖固相酸化物料可在微波作用下短時(shí)間內(nèi)快速均勻降解,高效制備重均分子量在10000～50000的低分子量殼聚糖,且糖單元的結(jié)構(gòu)在反應(yīng)過(guò)程中保持穩(wěn)定。當(dāng)降解目標(biāo)產(chǎn)物重均分子量低于10000時(shí)(例如殼寡糖),微波強(qiáng)化固相酸降解仍無(wú)法解決傳統(tǒng)殼聚糖酸降解收率低、狀態(tài)差的問(wèn)題。針對(duì)此問(wèn)題本研究提出采用微波強(qiáng)化殼聚糖固相酸降解和酶降解復(fù)合工藝,該工藝操作簡(jiǎn)便,可有效解決殼聚糖酸降解收率低和酶降解效率低的問(wèn)題,殼寡糖單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)能可提高4倍以上。

本研究制備的低分子量殼聚糖和殼寡糖以鹽酸鹽的形式存在,其在功能和生物活性方面與傳統(tǒng)殼聚糖酶降解制備的產(chǎn)品(多為醋酸鹽)是否存在差異,還需進(jìn)一步研究。