吳豐鵬,李芹英,*,吳彥超,李惠靜,*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東威海 264209; 2.威海海洋生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,山東威海 264400)

黃精(Polygonatumsibirieum)是藥食同源多年生的草本植物,根據(jù)其根莖的形狀不同習(xí)慣分為“雞頭黃精”、“姜形黃精”、“大黃精”。黃精屬于百合科黃精屬(PolygonatumMill.),目前全球共有黃精屬植物327種,我國(guó)共有79種[1]。作為中藥材,黃精味甘性平,歸脾、肺、腎經(jīng),具有健脾、潤(rùn)肺、益腎以及補(bǔ)氣養(yǎng)陰等功能[2],可用來(lái)治療肺虛燥熱、脾胃不和、體倦乏力、精血不足等癥狀,世人將黃精譽(yù)為“血?dú)怆p補(bǔ)之王”[3]。黃精中含有多種多樣的化學(xué)成分,含量最多的是多糖,約為14%左右,另外還有皂苷、氨基酸、木質(zhì)素、甾醇、黃酮、揮發(fā)油等重要的化學(xué)成分[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)藥用黃精的研究表明,黃精具有降血糖、降血脂[5]、抗炎[6]、抗病毒[7]、抗菌、抗腫瘤[8-9]、美容養(yǎng)顏、提高記憶力[10]、改善免疫力[11]等功效,具有較高的藥用價(jià)值及良好的市場(chǎng)前景。

近年來(lái),中醫(yī)治療技術(shù)得到了空前的發(fā)展,受到了越來(lái)越多人的青睞與重視[12]。中藥炮制品的制作主要是將生藥材進(jìn)行浸泡、蒸制、蜜制等過(guò)程,是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)的特色[13],數(shù)千年來(lái)用于身體的保健與疾病的治療。九蒸九制作為一種傳統(tǒng)的炮制中藥方法,一般用來(lái)炮制比較珍貴的藥材,如黃精、地黃、何首烏等大宗藥材,黃精未炮制前往往對(duì)人體具有刺激性和毒害副作用,經(jīng)炮制后消除了這些刺激性和毒害作用,還使其藥物成分和藥性得到改善,補(bǔ)益作用大大增強(qiáng)[14]。黃精炮制后其化學(xué)成分和藥理活性會(huì)發(fā)生不同程度的變化[15],而多糖是黃精中最主要的藥用成分,研究證明黃精多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理功效,炮制后多糖變化的具體研究尚不明確,因此,本文探究了黃精在九蒸九制炮制過(guò)程中多糖的含量及單糖組成變化,并對(duì)炮制過(guò)程中多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,以期發(fā)現(xiàn)黃精多糖最佳的炮制工藝,為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精 取自于山東威海2年生的雞頭黃精塊莖;葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、水楊酸(VC) 上海源葉生物科技有限公司;2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS) 上海麥克林生化科技有限公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司;磷酸二氫鉀、過(guò)硫酸鉀、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸、三氟乙酸(TFA)、苯酚、乙醇 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氯甲烷、正丁醇、甲醇、乙腈 色譜純,Fisher Scientific。

DZF6020型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 江南寧波制造廠;HHS-11-2型恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;LGJ-10E型真空冷凍干燥機(jī)、DL-5-B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社;UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器有限公司;SCL-10AVP型高效液相色譜儀 島津制作所;氮吹儀供氮機(jī) 杭州德克爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃精多糖的制備 黃精塊莖去除須根后清洗曬干,從生片開始,對(duì)黃精塊莖進(jìn)行清水蒸制(121 ℃,0.12 MPa,60 min),每蒸制一次后放入45 ℃烘箱至重量不再減少,留樣,重復(fù)九次[16],隨后進(jìn)行切片、打磨成粉末并過(guò)20目篩。稱取0～9次蒸制黃精粉末30 g,分別用80%的乙醇進(jìn)行脫脂處理及揮干乙醇后,在料液比為1∶20、溫度為60 ℃的條件下,用雙蒸水提取3 h,重復(fù)浸提3次,旋蒸濃縮,5倍體積的無(wú)水乙醇4 ℃靜置沉淀過(guò)夜,離心干燥即得黃精粗多糖。隨后采用Sevag法對(duì)粗多糖進(jìn)行蛋白質(zhì)脫除[17],重復(fù)5～6次去除蛋白質(zhì),40 ℃旋蒸去除殘留的有機(jī)溶劑,凍干,即得精制黃精多糖,根據(jù)蒸制次數(shù)將其分別命名為PSP0～PSP9。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品30.70 mg,置于100 mL的容量瓶中,加去離子水溶解并定容至100 mL,反復(fù)搖勻,可得0.307 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL,分別置于干凈試管中,并分別加去離子水至2 mL,各取100 μL于具塞試管中,依次加入新配置的6%苯酚溶液200 μL、濃硫酸溶液1 mL,搖勻后,在100 ℃水浴10 min,冷卻,以去離子水為空白溶劑同法操作作為空白對(duì)照,在489 nm處測(cè)定吸光度,以葡萄糖質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.0241X-0.0082,R2=0.9992。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的0～9次蒸制黃精樣品粉末1 g,按照“1.2.1”的方法進(jìn)行黃精多糖的提取,再移至50 mL容量瓶中,用去離子水定容至刻度,即得供試品溶液。

1.2.2.4 黃精九蒸九制過(guò)程中多糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確量取0.50 mL的各供試品溶液于干凈具塞試管中,按照“1.2.2.2”的方法測(cè)定各供試品的吸光度(Y),代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可計(jì)算多糖的質(zhì)量濃度,然后再計(jì)算出黃精多糖的含量。

1.2.3 黃精多糖中單糖組成分析

1.2.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品Glc、Man、Rha、GlcA、GalA、Gal、Ara各5 mg,各自配成5 mg/mL的水溶液待用。準(zhǔn)確吸取如上配好的各標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液10 μL于EP管中,并加水至100 μL,隨后按順序加入100 μL 0.30 mol/L的NaOH溶液,120 μL 0.50 mol/L的PMP-甲醇溶液,密封好后于70 ℃水浴鍋中水浴1 h,冷卻,再加入100 μL 0.30 mol/L的HCl中和至中性。加入500 μL三氯甲烷,漩渦振蕩,使三氯甲烷與樣品完全混合,再離心10 min,要上層水相,用注射器吸走下層,連續(xù)操作3次后上層水相用注射器吸取并過(guò)0.22 μm的濾膜,即得衍生化后的混標(biāo)[18]。

1.2.3.2 黃精多糖的衍生化 準(zhǔn)確稱取0～9次蒸制黃精精制多糖5 mg,各自配成5 mg/mL的水溶液待用。吸取各多糖溶液200 μL于安瓿瓶中,分別加入4 mol/L的TFA溶液200 μL,用酒精噴燈封瓶,于110 ℃烘箱中水解4 h。水解完后,用氮吹儀吹干,再加入200 μL的甲醇溶液繼續(xù)吹干,重復(fù)三次直至無(wú)TFA刺激性氣味。隨后加入150 μL的水溶解,吸取100 μL于EP管中,同“1.2.3.1”方法進(jìn)行衍生化。

1.2.3.3 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-3 C18,250×4.6 mm,5 μm,流動(dòng)相為0.10 mol/L的磷酸鹽緩沖液-乙腈(83∶17,pH=7.0),流速1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm,進(jìn)樣量5 μL,檢測(cè)時(shí)間40 min。

1.2.4 多糖的體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 取DPPH試劑,用乙醇配制成0.40 mmol/L的DPPH工作液待用。將多糖樣品配制成2、4、6、8、10 mg/mL不同濃度的多糖溶液,分別吸取0.50 mL于具塞試管中,再依次加入0.30 mL的DPPH工作液和2 mL的去離子水,同時(shí)設(shè)置對(duì)照和背景,置于黑暗處反應(yīng)30 min,每組樣品設(shè)置三組平行,并以相同濃度梯度的VC為陽(yáng)性對(duì)照[19]。反應(yīng)結(jié)束后,用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其在517 nm處的吸光度。DPPH清除率按該方程式計(jì)算:

C(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:C為清除率;A0為對(duì)照吸光度(0.50 mL水+0.30 mL DPPH工作液+2 mL水);A1為樣品吸光度(0.50 mL樣品+0.30 mL DPPH工作液+2 mL水);A2為背景吸光度(0.50 mL樣品+0.30 mL水+2 mL水)。

1.2.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定 將7 mmol/L的ABTS水溶液與2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀水溶液按1∶1的比例混合,于黑暗處?kù)o置12 h,之后加水稀釋,使其在734 nm處的紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)得的吸光度值為0.7±0.05,即ABTS工作液配制完成。將多糖樣品配制成2、4、6、8、10 mg/mL不同濃度的多糖溶液,分別吸取0.15 mL于具塞試管中,再加入3 mL的ABTS工作液,同時(shí)設(shè)置對(duì)照和背景,置于黑暗處反應(yīng)6 min,每組樣品設(shè)置三組平行,并以相同濃度梯度的VC為陽(yáng)性對(duì)照[20]。反應(yīng)結(jié)束后,用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其在734 nm處的吸光度。ABTS清除率按該方程式計(jì)算:

C(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:C為清除率;A0為對(duì)照吸光度(0.15 mL水+3 mL ABTS工作液);A1為樣品吸光度(0.15 mL樣品+3 mL ABTS工作液);A2為背景吸光度(0.15 mL樣品+3 mL水)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

選用Excel 2010、SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以及t檢驗(yàn)顯著性分析,并通過(guò)Graphpad prism 7.0軟件計(jì)算黃精多糖樣品DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的半抑制濃度IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量的測(cè)定

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0241X-0.0082,R2=0.9992,計(jì)算黃精多糖含量,結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出,未蒸制時(shí)黃精多糖含量最高,達(dá)到14.36%,隨著蒸制次數(shù)的增加,多糖含量逐漸減少,從第3次蒸制開始,多糖的含量趨于穩(wěn)定,保持在4%左右,與陳瑞瑞等[21]的結(jié)果一致。黃精經(jīng)過(guò)蒸制后,顏色逐漸加深,麻舌感逐漸消失,甜味增強(qiáng),說(shuō)明蒸制過(guò)程減弱了對(duì)人體的刺激性和毒害作用,并使口感變佳。但多糖的含量顯著減少,這是由于在蒸制過(guò)程中,持續(xù)高溫環(huán)境下多糖大量水解成單糖和低聚糖,從而導(dǎo)致蒸制后多糖含量減少。

圖1 0～9次蒸制黃精的多糖含量變化Fig.1 Polysaccharide content Changes of Polygonatum sibiricum steamed for 0～9 times

2.2 黃精多糖中單糖組成

圖2 酸降解后黃精多糖樣品的單糖組成HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of monosaccharide composition of PSPs after acidic hydrolysis注:Std為單糖混標(biāo),PSP0～PSP9為 0～9次蒸制次數(shù)的黃精多糖。

采用PMP衍生化-HPLC法檢測(cè)0～9次炮制后黃精精制多糖的單糖組成,單糖PMP衍生化后,可以使其帶上發(fā)色基團(tuán),具有紫外吸收,從而可以用紫外檢測(cè)器對(duì)單糖進(jìn)行定性定量分析[22]。檢測(cè)結(jié)果如圖2和表1所示。通過(guò)與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對(duì)比,以及出峰時(shí)間、峰面積的大小,可以判斷未蒸制黃精的多糖其單糖組成為Man、Glc、Gal、Ara,4種單糖的百分含量為52.47%、36.84%、7.32%、3.37%;蒸制后黃精多糖的單糖組成有所變化,隨著蒸制次數(shù)的增加,Man的含量不斷降低,從最初的52.4%減少至第九次蒸制時(shí)的18.86%;Glc的含量在前兩次蒸制中降低,但隨著蒸制次數(shù)的增加其含量又不斷增加,最高為第九次蒸制時(shí)的52.2%;Gal和Ara隨著蒸制次數(shù)的增加,其含量相對(duì)增加,其中Gal含量增加的量相對(duì)比較大。多糖在常溫條件下是比較穩(wěn)定的,而在蒸制過(guò)程高濕度和高溫的條件下,各種糖類成分可發(fā)生脫水反應(yīng)和降解反應(yīng),并且在其他成分如氨基酸的共同存在下會(huì)發(fā)生Maillard反應(yīng)[23],多糖由各種單糖構(gòu)成,其在炮制的過(guò)程中發(fā)生降解,進(jìn)而發(fā)生其他反應(yīng)變化,改變了多糖的單糖組成。

表1 九蒸九制黃精多糖的單糖組成分析Table 1 Monosaccharide composition of PSPs after nine-steam-nine-bask processing

2.3 多糖的體外抗氧化活性

DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基,顏色為紫色,它可用于測(cè)定各種抗氧化劑清除自由基的能力大小,抗氧化劑通過(guò)轉(zhuǎn)移電子或傳遞氫原子給DPPH，從而中和自身的自由基,所以可以從對(duì)DPPH自由基的清除能力來(lái)反映抗氧化劑的供氫能力[24]。ABTS作為一種比較穩(wěn)定的自由基,呈藍(lán)綠色,它可以與抗氧化劑結(jié)合發(fā)生顏色變化,可以通過(guò)顏色變化的程度在特定的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力[25]。如圖3、圖4所示,黃精多糖呈現(xiàn)出一定的抗氧化活性。從圖3中可以看出,黃精多糖對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力,隨著多糖濃度的提高其清除能力隨之提高,說(shuō)明清除能力與多糖濃度呈劑量依賴性;黃精多糖對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除的能力要比清除DPPH自由基的能力略高,并與多糖的濃度呈相關(guān)性,但黃精多糖的清除能力均低于VC的清除能力;經(jīng)蒸制后的黃精,其多糖對(duì)自由基的清除能力明顯高于未蒸制黃精(P<0.05),但蒸制次數(shù)對(duì)黃精多糖抗氧化活性影響不大,只是隨著蒸制次數(shù)的增加,抗氧化能力略微有所增加,如多糖濃度在10 mg/mL時(shí),未蒸制黃精的多糖對(duì)DPPH和ABTS的平均清除能力分別為53.89%和58.63%,蒸制1～9次時(shí)多糖對(duì)DPPH和ABTS的平均清除能力分別為在60.35%～67.86%、63.32%～69.74%之間。通過(guò)Graphpad prism7.0軟件計(jì)算黃精多糖樣品對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的半抑制濃度IC50值,如表2所示,未蒸制黃精的多糖對(duì)DPPH和ABTS平均清除能力的IC50值分別為8.71和7.53 mg/mL,經(jīng)蒸制后的黃精多糖對(duì)自由基平均清除能力的IC50值均低于未蒸制時(shí)黃精多糖的,說(shuō)明蒸制后的黃精多糖抗氧化性更強(qiáng)。

圖3 多糖對(duì)DPPH羥基自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH radicals by PSPs注:PSP0～PSP9為0～9次蒸制次數(shù)的黃精多糖。圖4同。

圖4 多糖對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS cationic free radicals by PSPs

表2 九蒸九制黃精多糖的抗氧化活性Table 2 The antioxidant activity of polysaccharide in Polygonatum sibirieum

3 結(jié)論與討論

黃精入藥前往往經(jīng)過(guò)炮制處理,炮制既可除去其刺激性,也方便保存,炮制前后其化學(xué)成分會(huì)發(fā)生不同程度的變化[26]。本研究采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定蒸制過(guò)程中黃精多糖含量的變化,得出黃精在蒸制過(guò)程中,隨著蒸制次數(shù)的增加,多糖含量逐漸減少,從最初的14.36%下降到4%左右,到蒸制第3次時(shí),黃精的多糖含量趨于穩(wěn)定并保持在4%左右;古法炮制講究九蒸九制,但從多糖含量的變化來(lái)看,蒸制3次與蒸制9次已無(wú)多大差別,后續(xù)的改變可能傾向于口感的變佳和其他藥效成分的增強(qiáng),但究竟蒸制3次與蒸制9次的黃精藥用效果是否一致,則需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

采用水提醇沉法制備炮制黃精的多糖,并對(duì)每次蒸制后提取的多糖進(jìn)行單糖組成分析測(cè)定,未蒸制黃精的多糖中主要由Man、Glc、Gal、Ara這4種單糖組成,其中Man含量最多,達(dá)到52.47%,其次是Glc,含量為36.84%,Gal的含量較低,為7.32%,Ara含量最低,含量為3.37%;通過(guò)蒸制后,Man含量減少,Glc含量先減少后增多,Gal和Ara含量增加,說(shuō)明蒸制過(guò)程對(duì)黃精多糖的單糖組成有一定影響,這可能與Maillard反應(yīng)有關(guān)。潘歡歡等[27]人對(duì)白術(shù)炮制過(guò)程中多糖與還原糖的含量變化進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)炮制過(guò)程中多糖和還原糖會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化和分解作用,而在炮制過(guò)程中高濕度和高溫的條件下,還原糖會(huì)參與Maillard反應(yīng)。Maillard反應(yīng)是一種非酶褐變反應(yīng),它涉及羰基化合物與氨基化合物間的反應(yīng),這在食品中很重要,因?yàn)檫@對(duì)食品的風(fēng)味和色澤起到?jīng)Q定性作用,另外Maillard反應(yīng)中往往會(huì)引起糖的異構(gòu)化和降解反應(yīng),從而改變多糖的單糖組成[28]。

通過(guò)對(duì)DPPH和ABTS自由基清除活性測(cè)定,可知黃精多糖具有一定的抗氧化活性,且抗氧化能力隨多糖的濃度增加而增大,未蒸制黃精的多糖其抗氧化活性低于蒸制后黃精多糖的抗氧化活性,但蒸制的次數(shù)對(duì)黃精多糖抗氧化活性并沒有過(guò)多的影響,只呈現(xiàn)略微增加的趨勢(shì)。單糖組成對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)有著影響作用,單糖組成的不同表明化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同,這對(duì)多糖的抗氧化活性及其他活性的發(fā)揮產(chǎn)生一定影響,為進(jìn)一步開發(fā)黃精的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供依據(jù)。