閆 爽,李光耀,戴叢書,崔昊震,柳振宇,林長青

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系,吉林延吉 133000)

糖尿病(Diabetesmellitus,DM)是由胰島細胞受損導(dǎo)致的一類慢性代謝性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計,全球范圍內(nèi)糖尿病患病人數(shù)已超過5億,且呈現(xiàn)逐年增長的趨勢,死亡人數(shù)也在逐年遞增,需要得到廣泛重視。對于糖尿病患者,病情的加重會產(chǎn)生多種并發(fā)癥,如脂質(zhì)代謝失調(diào)[2],腎病[3],肝損傷[4],視網(wǎng)膜病變[5]等,其嚴(yán)重?fù)p害身體各個器官。糖尿病又分為1型糖尿病和2型糖尿病(T2DM),其中90%的糖尿病患者為T2DM,T2DM主要發(fā)病于肥胖人群,主要特征是胰島素抵抗造成糖脂代謝紊亂[6-7]。脂代謝紊亂會直接引起其靶器官肝臟受到損傷,一般表現(xiàn)為肝腫大、脂肪肝、局部水腫等癥狀,嚴(yán)重影響著糖尿病患者的日常生活[8]。人參皂苷被視為在人參中發(fā)揮活性的主要成分,包括具有改善心肌損傷和炎癥的人參皂苷Rg1[9],抑制癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移作用的人參皂苷Rg5[10],改善阿爾茲海默癥的人參皂苷Rh1[11]等。Rg1、Rg5、Rh1等的人參皂苷都是從人參當(dāng)中能夠直接提取出來的活性成分,而人參皂苷CK(Compound K)是天然二醇型人參皂苷在腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物,是人參在體內(nèi)發(fā)揮活性的實體,不能夠從人參中直接提取出來。

目前對人參皂苷CK在抗腫瘤、抗炎、治療糖尿病方面研究較多,研究認(rèn)為人參皂苷CK能夠顯著抑制SW480細胞的增殖,作用機制可能是通過促進線粒體超氧化物升高,致使胞內(nèi)ROS水平顯著增加和MMP顯著下降,進而導(dǎo)致CytC釋放,上調(diào)Bax的表達,下調(diào)Bcl-2的表達,最終造成細胞凋亡[12]。此外,其還會通過調(diào)節(jié)炎癥因子的水平和NF-κB信號通路來發(fā)揮抗炎作用[13]。對于改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗作用,則認(rèn)為是通過增強大鼠機體抗氧化能力,降低氧化應(yīng)激損傷,增強葡萄糖轉(zhuǎn)運能力從而改善胰島素抵抗[14]。但目前對人參皂苷CK在治療T2DM肝損傷作用方面的研究相對較少。

因此本試驗通過建立T2DM大鼠模型,探討人參皂苷CK對T2DM大鼠肝損傷的保護機制,為其在糖尿病肝損傷的預(yù)防和治療上提供理論參考,為臨床應(yīng)用和保健品開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性無特定病原體(SPF)級SD大鼠 50只,體重200±20 g,長春億斯試驗動物中心;高脂高糖飼料、普通飼料 上海帆泊生物技術(shù)有限公司;鹽酸二甲雙胍片 北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司;鏈脲佐菌素(STZ) 美國Sigma公司;人參皂苷CK 上海源葉生物科技有限公司;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒 江蘇南京建城生物工程研究所;大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素IL-1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)ELISA試劑盒 武漢博士德生物公司;Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子(Myd88)、細胞核因子(p65)、肌動蛋白(β-actin) 美國Abcam公司;大鼠核因子κB抑制蛋白α(p-IκB-α) 美國CST公司。

九安AG-605血糖儀及血糖試紙 天津九安醫(yī)療電子股份有限公司;JJ224BC分析天平 生工生物工程上海股份有限公司;Olympus IX73熒光倒置顯微鏡 奧林巴斯中國有限公司;Bio-Rad Biorad 165-8002電泳儀 美國伯樂公司;Bio Spectrum 510凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及T2DM肝損傷動物模型的建立 T2DM肝損傷動物模型的建立方法參照安麗萍[14]的試驗方法并稍作調(diào)整,取10只健康雄性SD大鼠作為空白對照組,給予常規(guī)飼料喂養(yǎng),其余40只大鼠用高脂高糖飼料進行喂養(yǎng)6周,6周后對大鼠一次性腹腔注射STZ,劑量為30 mg·(kg·BW)-1,72 h后進行FBG測定,FBG水平高于16.7 mmol·L-1視為造模成功,一周后再次確定大鼠FBG水平是否高于16.7 mmol·L-1,將40只造模成功大鼠隨機分為模型組、人參皂苷CK低劑量組、人參皂苷CK高劑量組、二甲雙胍陽性對照組,每組10只。二甲雙胍組給予二甲雙胍0.2 g·kg-1灌胃,空白對照組和模型組灌胃相當(dāng)體積的蒸餾水,人參皂苷CK高劑量組給藥劑量為10.5 mg·kg-1,人參皂苷CK低劑量組給藥劑量為5.25 mg·kg-1[15],共灌胃給藥8周。試驗過程中,每兩周記錄所有大鼠的FBG。灌胃8周后進行心臟取血,解剖,取肝臟組織。嚴(yán)格遵守《延邊大學(xué)試驗動物的保護和使用指南》中的要求,符合動物試驗倫理要求。

1.2.2 T2DM大鼠OGTT的測定 在灌胃給藥8周后,進行OGTT試驗,以1 g/kg·BW灌胃葡萄糖,然后以0、30、60、90 min 為時間點分別測定大鼠血糖水平,并記錄其數(shù)值。

1.2.3 血清指標(biāo)檢測 心臟取血,置于10 mL試管中,4000 r·min-1離心15 min,取出血清,裝于EP管內(nèi),4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。TG、TC的測定:將血清取出放至室溫,依次按試劑盒說明書步驟進行操作,所有反應(yīng)液混勻后,37 ℃孵育10 min,于510 nm測定各孔吸光值并記錄。

HDL-C、LDL-C的測定:將血清取出放至室溫,依次按試劑盒說明書步驟進行操作,所有反應(yīng)液混勻后,37 ℃孵育5 min,546 nm測定吸光值A(chǔ)1,再向反應(yīng)體系中加入R2,混勻后,37 ℃孵育5 min,546 nm測定吸光值A(chǔ)2。

ALT、AST的測定:將血清取出放至室溫,依次按試劑盒說明書步驟進行操作,所有反應(yīng)液加完后,搖勻,室溫放置15 min,于510 nm測定各孔吸光值。所測得的吸光值均安說明書計算公式進行計算。

1.2.4 肝臟組織相關(guān)指標(biāo)檢測 解剖后肝臟組織在冰上剪碎,用生理鹽水洗去血水,置于試管中,按照m(組織重量)∶m(生理鹽水)=1∶9的比例制備組織勻漿,保存?zhèn)溆谩OD,MDA,GSH,CAT,TNF-α,IL-6,IFN-γ和IL-1β檢測參照試劑盒說明書,使用酶標(biāo)儀測定吸光度。

1.2.5 肝臟組織病理觀察 將肝臟組織用乙醇、二甲苯脫水后按常規(guī)方法用石蠟包埋,制成蠟塊。蠟塊經(jīng)切片機切成2 μm的薄片,撈片,置于60 ℃烘箱中15 min烘干,采用HE染色法進行染色。

1.2.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白的表達 用Western Blot法來測定TLR/Myd88/NF-κB信號通路中的相關(guān)蛋白。將肝臟組織和蛋白裂解液于研磨器中進行研磨,提取肝臟組織中的蛋白,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,按30 μg,20 μL進行上樣,電泳后100 V轉(zhuǎn)膜1 h,再將PVDF膜在5%的TBST脫脂奶中封閉1 h,用TBST將封閉液洗凈,防止封閉過度影響與一抗的結(jié)合。一抗按說明書比例進行稀釋,PVDF膜洗凈后孵育一抗,4 ℃過夜,TBST洗膜,室溫下二抗孵育1 h,使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照,并用Image J軟件進行分析。

表1 人參皂苷CK對T2DM大鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 1 Effects of ginsenoside CK on serum biochemical indexes in T2DM rats

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果重復(fù)三次,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(平均值±SD)表示。使用t檢驗和單方差分析(ANOVA)進行組間比較,P<0.05表示具有顯著性差異。使用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖尿病大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)

空腹血糖值能夠較直觀地反應(yīng)T2DM大鼠的患病情況,圖1為試驗期間所測得大鼠的FBG變化情況,由圖1中可知,在灌胃0周時,與空白對照組相比,模型組FBG均顯著升高(P<0.05),且均超過16.7 mmol·L-1,證明T2DM大鼠造模成功。隨著灌胃時間的延長,在灌胃8周時,與模型組相比,人參皂苷CK低、高劑量組、陽性組均能夠使大鼠FBG均顯著降低(P<0.05),使血糖值達到15 mmol·L-1以下,且人參皂苷CK高劑量組效果最好,顯示出較好的降血糖水平。

圖1 大鼠空腹血糖值變化情況Fig.1 Changes of fasting blood glucose in rat注:#表示與空白對照組相比,模型組數(shù)據(jù)差異顯著, P<0.05,##表示差異極顯著,P<0.01; *表示與模型組相比差異顯著,P<0.05, **表示差異極顯著,P<0.01；圖2～圖3，圖5、表1～表2同。

糖耐量能夠反應(yīng)出機體對體內(nèi)血糖濃度的調(diào)節(jié)能力,是對大鼠進行葡萄糖灌胃,并在不同時段對其血糖值進行測定,分析其葡萄糖耐受能力。圖2為大鼠糖耐量試驗結(jié)果,結(jié)果顯示,與空白對照組相比,模型組大鼠的血糖水平在0、30、60和90 min時顯著增加(P<0.05),與模型組相比,經(jīng)人參皂苷CK高、低劑量組處理的大鼠血糖水平在30、60和90 min時顯著降低(P<0.05),且人參皂苷CK高劑量組效果更好。CK高劑量組與陽性對照組顯示出相似的水平。

圖2 大鼠糖耐量試驗結(jié)果Fig.2 Results of rat glucose tolerance test

2.2 血清生化指標(biāo)變化

表1為血清生化指標(biāo)變化情況,由表1中數(shù)據(jù)可以看出,與空白對照組相比,T2DM大鼠中TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P<0.05),HDL-C水平顯著降低(P<0.05),經(jīng)CK低、高劑量組治療后可有效恢復(fù)TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,人參皂苷CK高劑量組與陽性對照組作用效果相當(dāng)。與空白對照組相比,T2DM大鼠中ALT,AST水平均顯著增加(P<0.05),經(jīng)CK低、高劑量組治療后可有效恢復(fù)該水平。

2.3 肝組織勻漿生化指標(biāo)變化

SOD、GSH、CAT、MDA是氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo),其數(shù)值的高低能夠反映出氧化應(yīng)激的水平,如表2所示,糖尿病大鼠的SOD、GSH、CAT的水平顯著低于空白對照組(P<0.05),經(jīng)人參皂苷CK治療后可有效恢復(fù)其水平,而糖尿病大鼠的MDA水平顯著高于空白對照組(P<0.05),經(jīng)人參皂苷CK治療后可降低其水平。在這些指標(biāo)中顯示人參皂苷CK高劑量組與陽性藥物組有相似的治療效果。

2.4 人參皂苷CK對T2DM大鼠肝組織炎性細胞因子的影響

細胞因子在大鼠免疫調(diào)節(jié)過程中具有重要作用,TNF-α又稱腫瘤壞死因子,是炎性反應(yīng)過程中的重要介質(zhì)。IL-6是巨噬細胞的標(biāo)志性細胞因子,能夠促進T淋巴細胞和淋巴細胞的增殖分化,在炎癥反應(yīng)以及免疫方面有著重要作用。IFN-γ是來自淋巴細胞培養(yǎng)上清中存在的一種干擾素,主要參與機體的免疫調(diào)節(jié)。IL-1β是白細胞介素1的一種亞型,同樣在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用[16]。圖3為人參皂苷CK對T2DM大鼠肝組織炎性細胞因子的影響圖,與空白對照組相比,模型組大鼠的促炎細胞因子的產(chǎn)生均有顯著增加(P<0.05)；而與模型組相比,經(jīng)人參皂苷CK治療后能夠顯著的降低肝組織炎性細胞因子的產(chǎn)生(P<0.05),且與陽性組的治療水平相近。

表2 人參皂苷CK對肝組織生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of ginsenoside CK on biochemical indexes of liver tissue

圖3 人參皂苷CK對T2DM大鼠肝組織炎性細胞因子的影響Fig.3 Effect of ginsenoside CK on inflammatory cytokines in liver tissue of T2DM rats注:(A)TNF-α含量;(B)IL-6含量;(C)IFN-γ含量;(D)IL-1β含量。

2.5 肝臟組織病理形態(tài)變化

圖4中顯示了肝組織情況,從圖4中能夠看出,正常大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整,肝索及肝竇結(jié)構(gòu)明顯;模型組大鼠肝臟組織肝索界限不清晰,肝竇出現(xiàn)異常,肝細胞質(zhì)有一定程度的空泡結(jié)構(gòu),組織結(jié)構(gòu)紊亂、排列不規(guī)則。經(jīng)人參皂苷CK治療后,肝組織水腫情況減弱,肝索排列規(guī)則,肝竇基本恢復(fù)正常,并與陽性組的治療水平相近。

圖4 人參皂苷CK對T2DM大鼠肝臟組織的影響Fig.4 Effect of ginsenoside CK on the liver tissue of T2DM rats注:A:正常對照組;B:模型組;C:人參皂苷CK低劑量組; D:人參皂苷CK高劑量組;E:陽性組。

圖5 人參皂苷CK對T2DM大鼠TLR4、Myd88、p-IκB-α蛋白表達的影響Fig.5 Effects of ginsenoside CK on the expression of TLR4,Myd88,P65 and p-IκB-α。注:(A)為蛋白條帶;(B)、(C)、(D)、(E)分別為TLR4、Myd88、p65、p-IKB-α的量化結(jié)果;#表示與空白對照組相比,模型組 數(shù)據(jù)差異顯著,P<0.05,##表示差異極顯著,P<0.01;*表示模型組相比差異顯著,P<0.05,**表示差異極顯著,P<0.01。

2.6 肝組織中相關(guān)蛋白的表達情況

TLR4、Myd88、p-IKB-α是NF-κB信號通路中的關(guān)鍵蛋白,圖5為肝組織中相關(guān)蛋白的表達情況,由圖5可知,與空白對照組相比,T2DM組大鼠TLR4、Myd88、p-65、p-IKB-α的表達量均顯著升高(P<0.05),與模型組比較,人參皂苷CK低、高劑量組能夠顯著降低其表達水平(P<0.05),且高劑量組顯示與陽性組相似的治療效果。

3 討論與結(jié)論

肝組織損傷是糖尿病并發(fā)癥的一種,損傷后會影響肝糖原、肌糖原對葡萄糖的轉(zhuǎn)化,從而影響糖尿病患者的血糖[17]。有研究指出[18],人參皂苷CK對T2DM大鼠有降糖作用,能夠抑制肝臟過度的糖異生,并能夠有效抑制其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),從而防治酒精性肝損傷[19]。過多的脂肪積累會導(dǎo)致代謝紊亂,在大多數(shù)情況下會導(dǎo)致T2DM以及肝損傷的發(fā)生[20]。在試驗中,T2DM大鼠的FBG顯著增加(P<0.05),經(jīng)人參皂苷CK治療后,大鼠的FBG有下降趨勢,且在糖耐量試驗中顯示經(jīng)人參皂苷CK治療后能夠顯著提高大鼠糖耐量能力(P<0.05),并與陽性對照組有相似的治療效果。與正常對照組相比,T2DM大鼠血清的TC、TG、LDL-C濃度顯著增加(P<0.05),而HDL-C濃度顯著降低(P<0.05),表明T2DM大鼠出現(xiàn)了脂代謝異常,脂肪分解增加,產(chǎn)生了大量的游離脂肪酸(FFA),組織吸收脂肪酸的能力降低,FFA大量釋放到血液和肝臟中,導(dǎo)致TC、TG、LDL-C的含量增多。臨床上常將AST和ALT聯(lián)合檢測,并以AST/ALT的比值來診斷患者肝組織病變情況,試驗中T2DM大鼠的AST、ALT值顯示經(jīng)人參皂苷CK治療后,能夠降低AST/ALT比值,有效恢復(fù)肝損傷病變的情況。當(dāng)機體內(nèi)氧自由基含量增多時,會使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),過多的氧自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成MDA,CAT與SOD在機體中具有較強的抗氧化能力,可抑制氧自由基的生成,從而降低氧自由基對細胞造成的傷害,并且可以降低MDA的生成量[21]。在唐俊等[22]指出,經(jīng)人參皂苷Rg3治療后,可有效提高SOD、GSH的水平,降低MDA水平,這與本試驗的研究結(jié)果一致。TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β四種細胞因子在調(diào)節(jié)免疫細胞以及炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。有研究顯示,對2型糖尿病患者治療后,體內(nèi)TNF-α以及IL-6炎性細胞因子的水平有所降低[23]。在本試驗中,顯示經(jīng)人參皂苷CK治療后能夠顯著的降低肝組織炎性細胞因子的產(chǎn)生。

推測人參皂苷CK對T2DM大鼠肝損傷的保護可能是通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),從而受到NF-κB途徑的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有的研究表明,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激通路中的相關(guān)分子可以改善胰島細胞的功能,進而促進葡萄糖的代謝和利用,減少對肝組織的損傷,并可通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)糖尿病相關(guān)疾病的調(diào)控[24-25]。TLR4、Myd88、p65、p-IκB-α是NF-κB信號通路中的關(guān)鍵蛋白。單佳鈴等[26]分析了藏族藥對慢性酒精性肝損傷的治療效果和可能機制,認(rèn)為對慢性酒精性肝損傷的保護機制可能與TLR/Myd88/NF-κB信號通路有關(guān)。另有研究認(rèn)為[27],對T2DM小鼠炎性因子的調(diào)節(jié)作用可能是通過調(diào)節(jié)TLR4/Myd88/NF-κB途徑中IκB的磷酸化水平來實現(xiàn),通過降低T2DM小鼠肝臟中IκB的磷酸化水平,可有效提高機體對葡萄糖的攝取能力,抑制炎性因子,改善肝損傷情況。在本研究中,試驗結(jié)果顯示肝損傷在T2DM大鼠中的發(fā)生與NF-κB信號通路中的重要分子TLR4、Myd88、p65、p-IκB-α的表達上調(diào)有關(guān),經(jīng)人參皂苷CK治療后能夠有效地降低這些蛋白的表達水平,改善了T2DM大鼠肝損傷的癥狀,減輕糖尿病對肝臟的傷害。由此可見,人參皂苷CK對T2DM大鼠肝損傷的保護作用可通過降低炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)來實現(xiàn)并受TLR/Myd88/p65/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)。這與Paudel等[28]的研究相一致,即減少炎癥的發(fā)生和氧化應(yīng)激反應(yīng)可以改善糖尿病肝損傷癥狀。

由此推測,人參皂苷CK對T2DM大鼠肝損傷的保護作用可通過降低炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)來實現(xiàn),并受TLR/Myd88/NF-κB通路的調(diào)節(jié)。然而,人參皂苷CK對糖尿病肝損傷調(diào)節(jié)的其他機制有待進一步研究。