劉 睿,劉欣然,珠 娜,郝云濤,康家偉,毛瑞雪,侯 超,張 黎,楊 嬌,李 勇

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100191)

酒精會引起全身多臟器的損傷,誘發(fā)一系列酒源性疾病,其中對胃腸道的損傷最為直接和嚴重,此外還是腫瘤、神經(jīng)精神性疾病、糖尿病、高血壓、心血管疾病等多種慢性病的危險因素。據(jù)統(tǒng)計酒精已造成了全球3.8%的死亡和4.6%的傷殘調(diào)整壽命年損失,急需引起人們的重視與關(guān)注[1]。作為一種常見的致潰瘍因子,高濃度的乙醇不僅可以直接腐蝕胃粘膜組織,同時還會引起大量自由基和炎性介質(zhì)生產(chǎn)與釋放,破壞胃黏膜屏障,引起炎癥滲出、水腫、糜爛、出血等損傷,引起胃潰瘍的產(chǎn)生[2]。酒精性胃潰瘍現(xiàn)已成為臨床上常見疾病,但現(xiàn)有臨床常用治療藥物副作用較多,不宜長期服用。因此,從天然活性物質(zhì)中尋找安全、有效的胃黏膜保護劑具有重要的社會價值和科研意義。

核桃(JuglansregiaL.)是已知最古老的食物來源之一,與扁桃、腰果、榛子并列為世界四大干果。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of United Nations,FAO)數(shù)據(jù)顯示,2017年全世界核桃產(chǎn)量達382.96萬噸,中國產(chǎn)量192.54萬噸,占世界總產(chǎn)量的50.28%,高居首位[3]。核桃具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值,古時即有“萬歲子”、“長壽果”等美譽,被歷代醫(yī)家和養(yǎng)生學(xué)家視為益壽精品,國外則稱為“二十一世紀超級食品”或“營養(yǎng)堅果”,在國際食品市場上占有重要地位[4-5]。核桃低聚肽(Walnut oligopeptides,WOPs)是利用生物酶解技術(shù)從核桃中提取的小分子生物活性肽,主要是由分子量很小但活性很高的短肽分子組成。目前研究已證實WOPs具有提高記憶力[6]、抗輻射[7]、抗疲勞[8]、提高性功能[9]等多種作用。但有關(guān)WOPs對酒精性胃潰瘍的研究尚無文獻報道,值得進一步探索研究。

因此,本研究在既往研究基礎(chǔ)上,擬采用無水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍動物模型,探討WOPs對乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍的保護及可其能機制,為WOPs在保健食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠(體重200±20 g) 70只,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心,實驗動物許可證號:SYXK(京)2016-0041,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0010;核桃低聚肽(WOPs) 外觀為淡黃色固體粉末,是通過生物酶解技術(shù)從普通核桃中分離得到的小分子生物活性肽類混合物,購自吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司。通過高效液相色譜法分析WOPs分子量及氨基酸組成,分子量小于1000的低聚肽占86.5%,小于2000的肽類總量占96.5%;無水乙醇(分析純) 購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司;奧美拉唑腸溶片(批準文號:國藥準字H19990114) 北京太洋藥業(yè)股份有限公司;前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)試劑盒 購自北京麥格泰克科技有限公司。

Adventurer TM通用型分析天平 美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;Eppendorf高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司;電熱恒溫水浴鍋 北京天林恒泰科技有限公司;Nihon Kohden Celltac 2全自動血球計數(shù)儀 日本光電工業(yè)株式會社;FSH-2A可調(diào)高速電動勻漿機 金壇市金南儀器廠;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司;FLUOstar Omega多功能酶標儀 德國 BMG LABTECH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及干預(yù) 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將大鼠隨機分為6個劑量組:正常對照組,模型對照組,陽性藥物對照組(奧美拉唑,劑量為20 mg/kg·bw),低、中、高WOPs劑量組(220、440、880 mg/kg·bw),每組10只。WOPs劑量設(shè)計依據(jù)為課題組前期研究發(fā)現(xiàn)當WOPs以440 mg/kg·bw劑量給實驗動物灌胃干預(yù)時,表現(xiàn)出較好的提高學(xué)習(xí)記憶、抗疲勞和增強免疫力的效果[6,8]。因此,本研究在此基礎(chǔ)上,以440 mg/kg·bw為中間劑量,設(shè)置了低、中、高三個WOPs劑量組,以進一步探索WOPs的最佳干預(yù)劑量。大鼠每日經(jīng)口灌胃干預(yù),正常對照組和模型對照組給予蒸餾水,陽性藥物對照組和WOPs劑量組給予相應(yīng)濃度受試物,灌胃量為1 mL/100 g。每周稱重兩次,灌胃干預(yù)時間為30 d。

1.2.2 模型制備 連續(xù)灌胃30 d后,全部動物禁食24 h(不禁水)。給予大鼠無水乙醇5 mL/kg灌胃,以造成實驗性胃潰瘍模型,正常對照組給予等量生理鹽水灌胃。無水乙醇灌胃1 h后,用乙醚麻醉處死動物,股動脈采血,快速剖腹取出全胃,進行下列指標的檢測。

1.2.3 Guth改良法計算胃潰瘍指數(shù) 乙醚麻醉處死動物后,開腹,取出全胃,沿著胃大彎剪開,冰凍生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物,觀察胃黏膜潰瘍發(fā)生情況,并用游標卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度,釆用Guth改良法[10-11]計算胃潰瘍指數(shù),計算標準如表1所示:

1.2.4 全血血常規(guī)檢測 快速取全血40 μL,加入提前接好4 mL稀釋液中,吹打均勻,用全自動血球計數(shù)儀測定大鼠血常規(guī)。主要檢測指標包括:白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、平均紅細胞體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)、單核細胞百分比、淋巴細胞百分比。

1.2.5 胃組織PGE2、NO、MPO及炎癥因子水平的測定 準確稱取胃組織重量,按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積勻漿介質(zhì),剪碎組織,冰水浴制備勻漿,3000 r/min,離心10 min,取上清即10%勻漿上清液貯藏于-20 ℃冰箱中。隨后根據(jù)試劑盒說明書依次檢測勻漿中PGE2、NO、MPO的含量。

表1 胃潰瘍指數(shù)計算標準Table 1 The scoring criteria of gastric ulcer index

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,行單因素方差分析,采用LSD法進行組間的統(tǒng)計檢驗;變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的數(shù)據(jù),采用Kruskal-Wallis檢驗進行統(tǒng)計分析。確定P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況

在30 d的試驗周期內(nèi),各試驗組大鼠外觀體征和行為活動、糞便性狀、食量等均未見異常,無中毒體征及死亡。

表2 WOPs對大鼠白細胞和血小板的影響Table 2 Effect of WOPs on white blood cell and platelet of rats

2.2 WOPs對大鼠胃潰瘍指數(shù)的影響

本研究通過參考人類常見致胃黏膜損傷因素及發(fā)病機理,建立了無水乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷模型來探討WOPs對胃黏膜損傷性疾病的可能保護作用。在使用無水乙醇5 mL/kg灌胃后,各組大鼠胃黏膜均呈現(xiàn)不同程度的損傷,損傷發(fā)生率達到100%,可判定造模成功。胃損傷指數(shù)如圖1所示,模型對照組胃潰瘍指數(shù)最高,與模型對照組相比,WOPs低、中、高劑量組胃潰瘍指數(shù)明顯降低(P<0.05)。陽性藥物(奧美拉唑)對照組的干預(yù)劑量是根據(jù)藥物說明書按人推薦服用劑量體重比進行轉(zhuǎn)化的,WOPs高劑量組胃潰瘍指數(shù)顯著低于陽性藥物對照組(P<0.05)。以上研究結(jié)果表明WOPs在一定程度上可以改善乙醇引起的胃損傷,對無水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍具有較好的保護作用。

圖1 WOPs對無水乙醇模型大鼠 胃黏膜損傷積分指數(shù)的影響Fig.1 Effect of WOPs on gastric ulcer index in ethanol-treated rats注:*表示各組與正常組相比,差異顯著(P<0.05), #表示各組(除正常對照組外)與模型組相比, 差異顯著(P<0.05),&表示劑量組與陽性藥物 對照組相比,差異顯著(P<0.05)。

2.3 WOPs對無水乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠血液學(xué)指標的影響

血常規(guī)是通過血液細胞形態(tài)分布及數(shù)量變化,及早發(fā)現(xiàn)或診斷疾病的一種指標,白細胞、紅細胞及血紅蛋白等相關(guān)指標是血常規(guī)檢測的核心內(nèi)容。白細胞包括中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞,在機體受到有害因素刺激及機體出現(xiàn)炎癥等情況下,體內(nèi)白細胞數(shù)目會明顯增加[12]。當機體在急性感染、受傷或者其他的原因引起血管破損時,血液血小板含量會升高,并釋放出促使血管收縮和血液凝固的物質(zhì)。紅細胞是血液中含量最多的血細胞,其數(shù)量與形態(tài)直接影響體內(nèi)外氣體交換以及正常機體免疫功能。血紅蛋白是紅細胞的主要組成部分,能與氧結(jié)合,運輸氧和二氧化碳,在血液氣體運輸方面扮演著重要的角色。

2.3.1 WOPs對大鼠白細胞和血小板的影響 無水乙醇模型大鼠血常規(guī)檢測結(jié)果結(jié)果如表2所示,模型對照組大鼠白細胞計數(shù)、單核細胞百分數(shù)較正常對照組顯著升高(P<0.05)。白細胞計數(shù)在WOPs中劑量和高劑量組,單核細胞百分數(shù)在陽性藥物對照組和WOPs低、中、高劑量組均顯著低于模型對照組(P<0.05)。血小板計數(shù)水平在奧美拉唑組顯著高于其他各組(P<0.05)。淋巴細胞比例在各組間未觀察到明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。以上研究結(jié)果說明無水乙醇激發(fā)了大鼠體內(nèi)白細胞的大量產(chǎn)生,而WOPs可以有效對抗酒精刺激引起的白細胞水平的升高。

表3 WOPs對大鼠紅細胞和血紅蛋白的影響Table 3 Effect of WOPs on red blood cell and hemoglobin of rats

表4 WOPs對大鼠胃組織PGE2、MPO和NO活性的影響Table 4 Effect of WOPs on the activities of PGE2,MPO,NO of gastric tissues in rats

2.3.2 WOPs對大鼠紅細胞和血紅蛋白的影響 如表3所示,陽性藥物對照組紅細胞計數(shù)水平高于正常對照組和模型對照組(P<0.05);與正常對照組相比,其它各組的紅細胞平均體積水平顯著降低(P<0.05);平均紅細胞血紅蛋白量水平在陽性藥物對照組顯著低于正常對照組組和模型對照組(P<0.05),在WOPs高劑量組高于奧美拉唑組(P<0.05);血紅蛋白、平均紅細胞血紅蛋白濃度在各組間未觀察到明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。陽性藥物對照組紅細胞計數(shù)增加,平均血紅蛋白水平下降,這可能與長期服用該藥物造成的不良反應(yīng)有關(guān),而WOPs干預(yù)則無此不良反應(yīng)。

2.4 WOPs對大鼠胃組織PGE2、NO、MPO活性的影響

本研究結(jié)果如表3所示,在無水乙醇灌胃造模后,與正常對照組相比,模型對照組PGE2水平顯著降低,MPO、NO水平升高(P<0.05),這與Saeed等[21]的研究結(jié)果一致。與模型對照組相比,MPO、NO活性在奧美拉唑組和WOPs各組均顯著下降,PGE2含量顯著增加(P<0.05)。與陽性藥物對照組相比,WOPs各組MPO、NO含量均升高,差異具有顯著性(P<0.05)。以上研究結(jié)果表明WOPs干預(yù)可明顯改善乙醇攝入導(dǎo)致的胃黏膜PGE2合成的減少,抑制中性粒細胞在胃組織的聚集浸潤和iNOS介導(dǎo)的NO的產(chǎn)生,從而發(fā)揮防護酒精引起的胃潰瘍的作用。

3 結(jié)論

WOPs可顯著降低大鼠胃潰瘍指數(shù),改善血白細胞水平的異常升高,并能通過增加胃組織PGE2水平,降低MPO、NO濃度起到對酒精性胃潰瘍的防護作用,表明WOPs對酒精性胃潰瘍的發(fā)生與發(fā)展具有一定的防護作用,具備被開發(fā)為新型輔助治療酒精性胃損傷功能保健品的潛力,這為WOPs應(yīng)用于胃黏膜損傷性疾病的預(yù)防和臨床輔助治療提供了科研依據(jù)。但目前對WOPs的研究還處在基礎(chǔ)研究階段,但其胃保護作用的深層機制有待進一步研究和探討,相應(yīng)的結(jié)果還需要進一步的人群實驗與臨床研究去證實。