馬曉玲，劉雪松，柴麗華，陳剛，李寧，魏鴻雁

·論著·

Tortoside A對人宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期影響的初步研究

馬曉玲，劉雪松，柴麗華，陳剛，李寧，魏鴻雁

830002 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所（馬曉玲、劉雪松、柴麗華、陳剛、魏鴻雁）；830046 烏魯木齊，新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（劉雪松、柴麗華）；110016 沈陽，沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院（李寧）

考察 Tortoside A（TOA）對人宮頸癌 SiHa 細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能機(jī)制。以 CCK-8 法、流式細(xì)胞術(shù)等檢測 TOA 對人宮頸癌細(xì)胞增殖抑制作用、對細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞周期的影響，Western blot 法檢測 TOA 對 SiHa 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。TOA 通過作用于Caspase、Bcl-2 家族蛋白而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了凋亡，并使細(xì)胞停滯于 G1 期，降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性。TOA 對 SiHa 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，其抑制作用可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

TOA； SiHa 細(xì)胞； 增殖； 凋亡

駱駝刺 Alhagi sparsifolia shap. 為豆科駱駝刺屬植物，是新疆干旱沙漠地區(qū)特有的一種植物，落葉灌木，耐旱、耐高溫、抗風(fēng)沙是它的特性[1-3]。課題組前期已對駱駝刺進(jìn)行了初步研究[4-8]，證實(shí)駱駝刺提取物具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[9-10]，對小鼠實(shí)體瘤模型具有一定的敏感性，抑瘤率達(dá)到 24.8%。經(jīng)過系統(tǒng)分離有效部分中的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)其中 Tortoside A（TOA）的含量較高[11-12]，有理由推測 TOA 可能是駱駝刺的主要有效成分之一。為了深入探討駱駝刺中分離得到的 TOA 對腫瘤細(xì)胞的影響，本研究通過體外培養(yǎng)人宮頸癌 SiHa 細(xì)胞，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)及多種分子生物學(xué)技術(shù)觀察 TOA 對宮頸癌 SiHa 細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其發(fā)生機(jī)制，為未來開發(fā)利用駱駝刺資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)對尋找新的抗癌藥物，充分挖掘利用新疆維吾爾藥資源是一項(xiàng)非常有意義的工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 TOA（結(jié)構(gòu)如圖1 所示）由沈陽藥科大學(xué)李寧教授提供，經(jīng) HPLC 面積歸一法純度約為 98.1%，用 DMSO 溶解，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 TOA 結(jié)構(gòu)

Figure 1 The structure of TOA

1.1.2 細(xì)胞 SiHa 人宮頸癌細(xì)胞株來源于凱基生物。

1.1.3 試劑 胎牛血清（FBS）為依科賽生物產(chǎn)品；DMEM（高糖）培養(yǎng)基（C11965500BT）為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；Cell Counting Kit-8 細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（FC101-03）、TransZol Up（ET111）、Easy II Protein Quantitative Kit (BCA)（DQ111-01）均為全式金生物產(chǎn)品；Giemsa 染液（D010）為南京建成公司產(chǎn)品；順鉑（P4394-25MG）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；5X All-In-One RT MasterMix（G492）為 Abm 公司產(chǎn)品；QuantiNava SYBRGreen Kit（208054）為凱捷公司產(chǎn)品；RIPA 裂解液（AR0105）為博士德公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和生物安全柜均購自上海力康儀器有限公司；Eclipse TS100-F 熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司；xMarkTM酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、PCR 儀均購自美國 Bio-Rad 公司；LSR II 流式細(xì)胞儀購自 BD 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀購自美國 ABI 公司；Chemiscope 3000 化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；DYCZ-24DN 電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立刻置于 37 ℃水浴中，快速晃動(dòng)凍存管，2 min 內(nèi)使細(xì)胞快速解凍，將解凍后的細(xì)胞快速加入提前加有 9 ml 完全培養(yǎng)基的 15 ml 離心管中，離心棄上清，將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，37 ℃、飽和濕度、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 2 ~ 3 天傳代一次。

1.2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率 取生長狀態(tài)良好，匯合率達(dá) 90% 的 SiHa 細(xì)胞，完全培養(yǎng)基制備成 5 × 104個(gè)/ml 單細(xì)胞懸液，接種至 96 孔板中（100 μl/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入 100 μl TOA（2.5、5、10、20、40、80 μg/ml）藥物，同時(shí)設(shè)置空白對照組（加入與實(shí)驗(yàn)組相當(dāng)?shù)?DMSO 溶劑），每組 5 個(gè)重復(fù)，放入培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。分別干預(yù) 48 h 后，每孔加入培養(yǎng)基總體積 10% 的 CCK-8，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育，1 h 后用酶標(biāo)儀測定 450 nm 處的值，根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算 IC50值。為捕捉細(xì)胞的凋亡信號(hào)，避免非凋亡性殺傷細(xì)胞過多，故在接下來的試驗(yàn)中將藥物干預(yù)的高、低劑量分別設(shè)置為1/2 IC50值和 1/4 IC50值。

1.2.3 細(xì)胞克隆形成能力的影響 參考 Lin 等[13]的實(shí)驗(yàn)方法，收集生長狀態(tài)良好匯合率達(dá)90% 的 SiHa 細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成密度為 100 個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液，按 200 個(gè)/孔接種到 6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 24 h 貼壁后，以不同濃度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和順鉑干預(yù) 24 h，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。15 d 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 2 次，4% 的甲醛室溫固定 20 min，PBS 洗 2 次，每孔加入 500 μl 的 Giemsa 染液 A 液，室溫染色 1 min，不棄去 A 液，加入 1 ml Giemsa 染液 B 液，繼續(xù)染色 5 min，棄去染色液，PBS 洗 3 次，晾干后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取生長狀態(tài)良好匯合率達(dá) 90% 的 SiHa 細(xì)胞，胰酶消化，用完全培養(yǎng)基制成密度為 5 × 104個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液，接種到 6 孔板中（2 ml/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，以不同濃度 TOA 和順鉑進(jìn)行干預(yù)，每組 3 個(gè)復(fù)孔。干預(yù) 48 h 后將培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)（內(nèi)含已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞），PBS 洗滌貼壁細(xì)胞兩次，將 PBS 一并收集至離心管內(nèi)，胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000 r/min 離心 5 min，棄上清。用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 遍，棄干凈上清。加入 400 μl AnnexinV 結(jié)合液重懸細(xì)胞，過 200 目篩網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液。加入 5 μl AnnexinV-FITC，輕輕混勻，4 ℃避光孵育 15 min。再加入 10 μl PI 染色液，輕輕混勻，4 ℃避光放置 5 min。在 30 min 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，AnnexinV-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取生長狀態(tài)良好匯合率達(dá) 90% 的 SiHa 細(xì)胞，胰酶消化，用完全培養(yǎng)基制成密度為 5 × 104個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液，接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，以不同濃度 TOA 和順鉑進(jìn)行干預(yù) 48 h，每組 3 個(gè)復(fù)孔。胰酶消化干預(yù)后的細(xì)胞，用 5 ml 的 PBS 洗一遍，用 500 μl 預(yù)冷 PBS 重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入到 3.5 ml 預(yù)冷的 80% 乙醇中，4 ℃固定過夜。2500 r/min 離心 5 min，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，以避免吸走細(xì)胞。用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 遍，棄干凈上清。加入 500 μl PI/RNase Staining Buffer 重懸細(xì)胞，過 200 目尼龍篩網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液。4 ℃避光孵育 30 min。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長 488 nm 處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況。分析軟件進(jìn)行細(xì)胞 DNA 含量分析和光散射分析。

1.2.6 JC-1 測定線粒體膜電位 將 SiHa 細(xì)胞，完全培養(yǎng)基制備成 5 × 104個(gè)/ml 單細(xì)胞懸液，以 2 ml/孔接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基，以不同濃度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和順鉑干預(yù) 48 h，每組 3 個(gè)復(fù)孔。胰酶消化各組細(xì)胞，離心棄上清，用 1 ml PBS 重懸細(xì)胞于 1.5 ml 離心管中，離心吸掉上清。用0.5 ml JC-1 工作液重懸細(xì)胞，于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育 15 min。400 ×離心 5 min，棄去上清，用 1 ml PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，之后離心，吸掉上清，用 0.5 ml PBS 重懸細(xì)胞，過 200 目篩網(wǎng)，30 min 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.7 Hoechst 染色檢測細(xì)胞凋亡情況 將 SiHa 細(xì)胞，完全培養(yǎng)基制備成 5 × 104個(gè)/ml 單細(xì)胞懸液，接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，以不同濃度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和順鉑進(jìn)行干預(yù)，每組 3 個(gè)復(fù)孔。干預(yù) 48 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 2 次，4% 的多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 2 次，每孔加入 500 μl 的 Hoechst 染色液，室溫染色 5 min，棄去染色液，PBS 洗 2 次，在顯微鏡下激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長參數(shù)為 460 nm 時(shí)，觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 Western blot 檢測凋亡蛋白的表達(dá) 參考朱晗清和高豐厚[14]的試驗(yàn)方法，用不同濃度的 TOA 處理 SiHa 細(xì)胞 24 h，使用 RIPA 裂解液和 PMSF（RIPA:PMSF = 100:1）從 SiHa 細(xì)胞中提取總蛋白。用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。通過 10% SDS-聚丙烯酰胺電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉在室溫下封閉 1 h。然后在 4 ℃條件下進(jìn)行一抗孵育過夜，TBST 清洗 3 次，膜與兔抗/鼠抗在室溫調(diào)節(jié)下孵育 1 h，再用 TBST 清洗 3 次，最后用ChemiScope mini 化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照，并對各蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，將β-actin 作為內(nèi)參，用目的條帶與β-actin 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TOA 對 SiHa 細(xì)胞增殖抑制率的影響

由表1 可知，TOA 高濃度組存活率低于低濃度組，呈明顯的劑量依賴關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。化合物 TOA 對 SiHa 細(xì)胞的生長抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)可定量分析單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力，清楚細(xì)胞的增殖和獨(dú)立生存能力[14]。分別用不同濃度藥物處理 SiHa 細(xì)胞后，檢測細(xì)胞的克隆形成能力[15]。從圖2中，我們可以明顯觀察出藥物干預(yù)的細(xì)胞同空白組相比，細(xì)胞克隆形成的明顯較少。其定量分析結(jié)果見表2 所示：同空白組比較，化合物 TOA 干預(yù)細(xì)胞后，形成的克隆數(shù)量明顯減少（< 0.05）。

表1 TOA 對細(xì)胞增殖抑制率及 IC50值的影響（，n = 5）

注：*與空白對照組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

圖2 TOA 對 SiHa 細(xì)胞克隆形成作用

Figure 2 Effect on SiHa cells clone formation of TOA

表2 不同濃度 TOA 對 SiHa 細(xì)胞克隆形成的作用（，n = 3）

注：*與空白組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

圖3 TOA 作用于 SiHa 細(xì)胞 Hoechst 染色圖片

Figure 3 Effect of TOA on colony formation in SiHa cells

圖4 SiHa 細(xì)胞線粒體膜電位檢測流式圖

Figure 4 Effect of TOA on depolarization of mitochondrial membrane potential in SiHa cells

2.3 Hoechst 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效的主要指標(biāo)之一，本試驗(yàn)通過 Hoechst 染色，在顯微鏡下觀察經(jīng) TOA 處理后的 SiHa 細(xì)胞凋亡發(fā)生的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，熒光顯微鏡下觀察，TOA 高劑量組出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀熒光，可見細(xì)胞熒光明顯增強(qiáng)，部分出現(xiàn)高染，細(xì)胞核固縮、碎裂增多以及部分可見細(xì)胞核中染色體匯集于兩端，呈典型的凋亡特征，由此可見 TOA 能顯著促進(jìn) SiHa 細(xì)胞凋亡。

2.4 線粒體膜電位檢測結(jié)果

腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的降低是腫瘤細(xì)胞早期凋亡的特征之一，故本試驗(yàn)采用 JC-1 染色，以流式細(xì)胞儀檢測經(jīng) TOA 處理后的 SiHa 細(xì)胞的線粒體膜電位[16]。在圖4的象限中可觀察到膜電位降低的變化。其定量分析結(jié)果如表3 所示，與空白組比較，TOA 高、低劑量組處理 SiHa 細(xì)胞 48 h 后，其線粒體膜電位下降比率分別達(dá)到（14.500 ± 0.755）% 和（12.847 ± 0.404）%，有顯著差異（< 0.01）。

表3 流式檢測 TOA 對 SiHa 細(xì)胞線粒體膜電位的作用（，n = 3）

注：*與空白組比較，< 0.01。

Note:*Compared with control group,< 0.01.

圖5 TOA 作用于 SiHa 細(xì)胞凋亡檢測流式圖

Figure 5 Effect on apoptosis of SiHa cells by flow cytometry

2.5 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

Annexin V-FITC/PI 染色后，可標(biāo)示處于正常細(xì)胞群、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡和壞死細(xì)胞等不同細(xì)胞群[16]。如圖5 所示，TOA 作用 48 h后，可顯著誘導(dǎo) SiHa 細(xì)胞發(fā)生凋亡，而隨著 TOA濃度增加，細(xì)胞凋亡率也有所增加，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

2.6 細(xì)胞周期檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6、圖7所示，作用 48 h 后，TOA 可使 SiHa 細(xì)胞 G0/G1 期細(xì)胞所占的百分比增加，提示 TOA 可使細(xì)胞均阻滯于 G1 期，所以我們認(rèn)為 TOA 對于細(xì)胞的阻滯是發(fā)生在G1 期的。

表4 流式檢測 TOA 對 SiHa 細(xì)胞凋亡的作用（，n = 3）

注：*與空白組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

圖6 SiHa 細(xì)胞周期檢測流式圖

Figure 6 The flow chart of SiHa cells cycle detected by TOA intervention

圖7 TOA 干預(yù) SiHa 細(xì)胞周期作圖

Figure 7 Effect on apoptosis of SiHa cells

圖8 Western blot 實(shí)驗(yàn)條帶圖及柱狀圖

Figure 8 The chart of Western blot experiment

2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖8 所示，TOA 作用于 SiHa 細(xì)胞 24 h 后，與對照組相比，Caspase-3 和Caspase-7 表達(dá)增加，同時(shí)Caspase-3 的底物 PARP 蛋白被剪切活化，亦顯著降低 Bcl-2 的表達(dá)。說明 TOA 誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡可能與 Caspase 家族有關(guān)。

3 討論

駱駝刺 Alhagi sparsifolia shap. 為豆科駱駝刺屬植物，在本研究中，我們首先考察了 TOA 對人宮頸癌細(xì)胞 SiHa 的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，TOA 對細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)。繼而通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率可以得出這樣的結(jié)論：TOA 能夠誘導(dǎo) SiHa 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，死亡信號(hào)通過細(xì)胞表面的信號(hào)分子傳遞到Caspase-7 并將其激活，繼而引起Caspase-3 的激活，誘導(dǎo)凋亡[17-18]。Western blot 的結(jié)果顯示，TOA 作用后能使Caspase-3 和 Caspase-7 的表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞中 Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)剪切Caspase-3 的底物 PARP。推測 TOA 誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡可能與 Caspase、Bcl 家族有關(guān)。細(xì)胞增殖和凋亡水平的改變常與細(xì)胞周期調(diào)控的變化有關(guān)。細(xì)胞周期沿著 G1、S、G2、M 期的順序運(yùn)轉(zhuǎn)[19]。G1 期是啟動(dòng)細(xì)胞周期循環(huán)的關(guān)鍵，其運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)是多種疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，也是藥物發(fā)揮治療作用的切入點(diǎn)[20]。本實(shí)驗(yàn)顯示，TOA 可以使宮頸癌細(xì)胞停滯于 G1 期，阻止其向 S 期及 M 期轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細(xì)胞生長緩慢并降低其增殖活性。因此，TOA 誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生了凋亡，并使細(xì)胞停滯于 G1 期，降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性。TOA 可以作為一個(gè)潛在抗宮頸癌藥物先導(dǎo)化合物，對其作用機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

[1] Xiang Y, Liu X, Zhang J, et al. Camellia oleifera dregs protein and modified Zn-Ca-Fe-LDH for enhancing enzymatic saccharification and ethanol production of Alhagi sparsifolia Shap. Energy Sources, Part A Recovery Utilization Environ Effects, 2020, 42(10):1217-1224.

[2] Xiang Y, Xiang Y, Wang L, et al. Effects of sewage sludge modified by coal gasification slag and electron beam irradiation on the growth of Alhagi sparsifolia Shap. and transfer of heavy metals. Environ Sci Pollut Res Int, 2018, 25(12):11636-11645.

[3] Liu YX. Desert flora of China. Beijing: Science Press, 1985:182. (in Chinese)

劉瑛心. 中國沙漠植物志. 北京: 科學(xué)出版社, 1985:182.

[4] Ma XL, Shi LL, Liu XS, et al. Effects of Alhagi sparsifolia Shap extract on abdominal electrical activities and NO levels in diarrhea-induced irritable bowel syndrome (IBS-D) Rats. Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2018, 34(5):78-81. (in Chinese)

馬曉玲, 石磊嶺, 劉雪松, 等. 駱駝刺提取物對腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)模型大鼠腹壁肌電活動(dòng)及血清NO水平的調(diào)節(jié)作用研究. 中藥藥理與臨床, 2018, 34(5):78-81.

[5] Institute of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine, Xinjiang Uygur Autonomous Region of China. Application of Alhagi alba extract as a preparation drug for the treatment of irritable bowelsyndrome. 中國: CN201610411321.X. 2016-09-21. (in Chinese)

新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所. 駱駝刺提取物作為制備治療腸易激綜合征藥物的應(yīng)用. 中國: CN201610411321.X. 2016-09- 21.

[6] Liu XS, Ma XL, Shi LL, et al. Separation and purification of Alhagi sparsifolia n-butanol extract monomeric compounds and study on theireffects on human cervical cancer HeLa cells. China Pharm, 2019, 30(4):506-512. (in Chinese)

劉雪松, 馬曉玲, 石磊嶺, 等. 駱駝刺正丁醇萃取部位中單體化合物的分離純化及其對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響研究. 中國藥房, 2019, 30(4):506-512.

[7] Liu XS, Wei HY, Shi LL, et al. Effects of Alhagi sparsifolia Shap extract on water metabolism and gastrointestinal hormone levels in rats with diarrhea-predominant of irritable bowel syndrome. Chin J New Drugs Clin Remedies, 2019, 38(3):169-173. (in Chinese)

劉雪松, 魏鴻雁, 石磊嶺, 等. 駱駝刺提取物對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠水液代謝和胃腸激素水平的影響. 中國新藥與臨床雜志, 2019, 38(3):169-173.

[8] Ma XL, Wei HY, Jia XG, et al. The long-term toxicity experiment of Alhagi sparsifolia shap (L.) capsule in rats. Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2014, 30(2):113-115. (in Chinese)

馬曉玲, 魏鴻雁, 賈曉光, 等. 駱駝刺膠囊對大鼠的長期毒性. 中藥藥理與臨床, 2014, 30(2):113-115.

[9] Ma XL, Shi LL, Liu XS, et al. Preparation of Alhagi sparsifolia Shap monomer compound and screening the antitumor active fractions in vitro. Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2018, 34(4):58-61. (in Chinese)

馬曉玲, 石磊嶺, 劉雪松, 等. 駱駝刺單體化合物的制備及其體外抗腫瘤作用的篩選. 中藥藥理與臨床, 2018, 34(4):58-61.

[10] Ma XL, Liu XS, Wei HY, et al. Preparation of Alhagi sparsifolia Shap monomer compound and screening for Hela cell activity of Human cervical cancer. J Xinjiang Med Univ, 2018, 41(4):486-490. (in Chinese)

馬曉玲, 劉雪松, 魏鴻雁, 等. 駱駝刺單體化合物的制備及其抗人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性的研究. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 41(4): 486-490.

[11] Ma XL, Xu JG, Xiatiguli A, et al. Effects of Alhagi sparsifolia shap (L.) extract on delayed type hypersensitivity of immunosuppression mice. Xinjiang Med J, 2017, 47(10):1103-1105. (in Chinese)

馬曉玲, 徐建國, 夏提古麗?阿不利孜, 等. 駱駝刺提取物對免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用. 新疆醫(yī)學(xué), 2017, 47(10):1103- 1105.

[12] Ma XL, Wei HY, Xu XQ, et al. Antitumor activity of Alhagi sparsifolia shap (L.) extract in vivo and in vitro. Nat Product Res Dev, 2015, 27(3):517-520. (in Chinese)

馬曉玲, 魏鴻雁, 徐曉琴, 等. 駱駝刺提取物體內(nèi)外抗腫瘤作用及機(jī)制初探. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2015, 27(3):517-520.

[13] Lin L, Guo C, Bing Z, et al. Lycium barbarum polysaccharide induced apoptosis and inhibited proliferation in infantile hemangioma endothelial cells via down regulation of PI3K/AKT signaling pathway. Biosci Rep, 2019, 39(8):BSR20191182.

[14] Zhu HQ, Gao FH. Oridonin up-regulated p53 transcriptional activitypromoted apoptosis of glioma cells and its molecular mechanism.J Mod Oncol, 2019, 27(7):1140-1144. (in Chinese)

朱晗清, 高豐厚. 冬凌草甲素上調(diào) p53 轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用與分子機(jī)制探討. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2019, 27(7):1140-1144.

[15] Du JY, Xu Y, Wang N, et al. Mechanism of active fractions from hedyotidis herba-scutellariae barbatae herba in inducing apoptosis of MDA-MB-231 cells. Chin J Exp Traditional Med Formulae, 2018, 24(17):99-107. (in Chinese)

杜江洋, 徐元, 王楠, 等. 白花蛇舌草-半枝蓮藥對組分誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2018, 24(17):99-107.

[16] Liu CH, Wang JY, Yin C, et al. Expression of EpCAM in non-small cell lung cancer cells and its effects on cell proliferation and invasion. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2019, 54(1):59-63. (in Chinese)

劉春華, 王俊軼, 銀春, 等. 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中上皮特異性黏附分子的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2019, 54(1):59-63.

[17] Zhang LJ, Zhang LL, Huang WH, et al. Effects of triptonoterpene methyl ether on proliferation and apoptosis of human gastric adenocarcinoma AGS cells. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30(8):1066- 1072. (in Chinese)

張麗靜, 張蕾蕾, 黃文華, 等. 雷酚萜甲醚抑制人胃癌細(xì)胞 AGS 增殖及誘導(dǎo)凋亡作用研究. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(8):1066- 1072.

[18] Du J. MiRNA-451 inhibits the metastasis and EMT of triple-negative breast cancer by targeting c-Myc. Urumqi: Xinjiang Medical University, 2020. (in Chinese)

杜江. MiRNA-451調(diào)控c-Myc在三陰性乳腺癌侵襲結(jié)轉(zhuǎn)移中作用的研究. 烏魯木齊: 新疆醫(yī)科大學(xué), 2020.

[19] Zhu QH, Luo MH, Zhou CY, et al. Effect of danusertib on cell cycle, apoptosis and autophagy of hepatocellular carcinoma HepG2 cells in vitro. J Southern Med Univ, 2018, 38(12):1476-1484. (in Chinese)

朱橋華, 羅美華, 周成宇, 等. 抑制極光激酶活性對肝癌HepG2細(xì)胞周期、凋亡和自噬的影響. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 38(12): 1476-1484.

[20] Lowe SW, Lin AW. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis, 2000, 21(3): 485-495.

Tortoside A induces apoptosis of human cervical cancer cells and affects cell cycle in the initial research

MA Xiao-ling, LIU Xue-song, CHAI Li-hua, CHEN Gang, LI Ning, WEI Hong-yan

Author Affiliations:Xinjiang Institute of Chinese Medicine and Medicine of National, Urumqi 830002, China (MA Xiao-ling, LIU Xue-song, CHAI Li-hua, CHEN Gang, WEI Hong-yan); College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China (LIU Xue-song, CHAI Li-hua); School of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Pharmaceutical University, Shen Yang 110016, China (LI Ning)

The possible mechanism on the proliferation and apoptosis of human cervical cancer cells effected by TOA was investigated.The CCK-8 method was used to detect the inhibitory effect of TOA on the proliferation of human cervical cancer cells, the apoptosis level and cell cycle of cervical cancer cells detected by flow cytometry, the related protein expression apoptosis of cervical cancer cells were detected by Western blot.TOA induced apoptosis of cervical cancer cells by acting on Caspase and Bcl-2 family proteins, and arrested the cells in the G1 phase, reducing the proliferation activity of tumor cells.TOA has an inhibitory effect on the proliferation of cervical cancer cells, and its inhibitory effect may be related to the promotion of cell apoptosis.

TOA; SiHa cell; proliferation; apoptosis

WEI Hong-yan, Email: whywlmq@sina.com

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2018D01B12）

魏鴻雁，Email：whywlmq@sina.com

2020-11-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.007