詹蕓，李瑞，蔣建東，韓燕星

·論著·

綠原酸通過下調(diào)Notch1的表達抑制食管癌細胞的克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移

詹蕓，李瑞，蔣建東，韓燕星

100050 北京，中國醫(yī)學科學院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室

考察 Notch1 在綠原酸（CGA）抑制食管癌過程中的作用及機制。采用表達譜芯片檢測食管癌小鼠食管組織中的差異基因表達，并用免疫組化（IHC）染色方法進行驗證；用 CGA 對不同的食管癌細胞系進行處理，通過 Western blot 檢測不同細胞中 Notch1 的表達變化情況。采用 RNAi 技術(shù)敲降食管癌細胞中 Notch1 的表達，再加入 CGA 處理，利用克隆形成實驗和 Transwell 實驗檢測食管癌細胞的克隆形成能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化情況。通過表達譜芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn) Notch1 在接受 CGA 治療的食管癌小鼠食管組織內(nèi)的表達下降，并且 IHC 染色結(jié)果證實這一變化。Western blot 結(jié)果顯示，CGA 能夠抑制不同食管癌細胞中 Notch1 的表達，并且這種抑制作用會隨著 CGA 處理濃度的增加而逐漸增強。采用 RNAi 技術(shù)敲降食管癌細胞中的 Notch1 后加入 CGA 進行克隆形成實驗和 Transwell 實驗，結(jié)果均表明，在正常表達 Notch1 的食管癌細胞中，經(jīng)過 CGA 處理的細胞所形成的克隆團數(shù)目與發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細胞數(shù)目遠遠低于對照組，而敲降 Notch1 之后，兩組細胞所形成的克隆團數(shù)和發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細胞數(shù)量未有明顯的差異。Notch1 是 CGA 的作用靶點之一，CGA 通過作用于 Notch1 進而抑制食管癌細胞的克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移。

綠原酸； Notch1； 食管癌； 克隆形成； 侵襲

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率分別居于全部惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率的第九位和第六位[1]。我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，其死亡率僅次于肺癌、胃癌及肝癌[2]。Notch1 是一種高度保守的細胞跨膜蛋白，參與調(diào)節(jié)多種重要的生物學進程，例如細胞增殖、凋亡、分化等[3]。研究表明 Notch1 的異常廣泛存在于多種腫瘤中[4]。在食管癌中，Notch1 常常出現(xiàn)表達或者功能異常，是食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子之一[5]。

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是一種水溶性酚類化合物，在多種植物中存在，具有廣泛的生物學活性，包括抗腫瘤活性，在臨床腫瘤治療中展現(xiàn)出了良好的治療效果。本課題組前期工作已經(jīng)證實 CGA 能夠有效抑制食管癌細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[6]，但其作用機制尚不明確。本實驗首先通過動物模型證實了 CGA 對 Notch1 的調(diào)節(jié)作用，再用體外細胞模型進一步探討 Notch1 在 CGA 抑制食管癌細胞過程中的具體作用與機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25% 胰酶、青鏈霉素和胎牛血清購自美國 Gibco 公司；RNA 干擾所用 siRNAs（siNotch1-1、siNotch1-2）和陰性對照（NC）由美國 Ambion（Thermo）公司設(shè)計合成；轉(zhuǎn)染試劑 Hiperfect 購自美國 Qiagen 公司；RNA 提取試劑盒TrizolTMplus RNA Purification Kit 購自美國 Invitrogen 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（4368813）、SYBR Green實時定量 PCR 試劑盒 PowerUp SYBR Green Master Mix（A25742）均購自美國Applied Biosystems 公司；Matrigel Matrix 購自美國 BD 公司；抗體 Notch1（CST-3608）、β-actin（CST-4970）均購自美國 Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) KYSE30、KYSE140、KYSE180 及 KYSE510 細胞均來自于東京大學Y.Shimada 博士的饋贈。采用含 10% 胎牛血清及 1% 青鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA 的轉(zhuǎn)染 將細胞接種至 6 孔板中，并調(diào)整細胞密度至 50% 左右，培養(yǎng)12 ～ 16 h，將 Hiperfect 與適量 siRNA 混合加入 Opti-MEM 中，渦旋混勻并簡短離心，室溫下靜置 10 min，再將其加入 6 孔板中，待轉(zhuǎn)染 24 h 后，再進行不同的處理。

1.2.3 克隆形成實驗 將 siRNA 轉(zhuǎn)染 24 h 后的細胞用胰酶消化后計數(shù)接種于 6 孔板中，每個孔接種 300 個細胞，加入含有 CGA（50 μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 周，冰甲醇固定并用 0.5% 結(jié)晶紫染色，拍照，光鏡下觀察并記錄細胞個數(shù)在50 個以上的克隆。

1.2.4 侵襲轉(zhuǎn)移實驗 細胞先經(jīng) siRNA 轉(zhuǎn)染24 h 后，加入 CGA（50 μmol/L）預(yù)處理 24 h，然后將細胞消化計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基重懸使細胞濃度為 1 ×107個/ml，取 100 μl 細胞懸液小心加入預(yù)鋪 Matrigel 膠的Transwell 上室中，并在下室中加入含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24 h，拭去上室內(nèi)的細胞，甲醇固定并用 0.5% 結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 RNA 提取及 qRT-PCR 檢測 收取 siRNA轉(zhuǎn)染后的細胞，預(yù)冷 1 × PBS 清洗，用細胞刮刀將細胞小心刮下，收集至離心管中，離心棄去上清，加入適量Trizol，用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA。取 1 μg 總 RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，按照試劑盒說明書進行 real-time PCR 檢測 Notch1 的表達，以管家基因 GAPDH 的表達作為內(nèi)參，并用 2-ΔΔCt方法進行定量分析。GAPDH 及 Notch1 的引物序列如下：GAPDH 正向 5' CTCCC ACTCTTCCACCTTCG 3'，反向 5' TAGGGCCTCT CTTGCTCAGT 3'；Notch 1 正向5' GGTGAGACCT GCCTGAATG 3'，反向 5' GTTGGGGTCCTGGCA TC 3'。

1.2.6 Western blot 提取細胞內(nèi)總蛋白，用 BCA 法測定蛋白濃度，取 30 μg 總蛋白進行 SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉非特異性抗原，分別加入一抗（均為 1:1000 稀釋）于 4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:5000）室溫孵育 2 h，TBST 洗膜后用電化學發(fā)光法（electro-chemi-luminescence，ECL）顯色成像，得到蛋白免疫印記條帶，以 β-actin 蛋白條帶作為參照。

1.2.7 動物實驗取材及免疫組化 本實驗用動物購自北京維通利華有限公司。動物實驗遵循北京實驗動物管理委員會的規(guī)定。給予 6 周齡雄性 C57 小鼠100 μg/ml 的4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide，4-NQO）水溶液，持續(xù)喂水 16 周，從第 22 周開始給予 CGA 50 mg/(kg·d) 或者同等體積生理鹽水（NS）腹腔注射，詳細的動物實驗?zāi)Ｐ徒⒎椒▍⒖急菊n題組之前的文章[6]。給藥 6 周后處死小鼠取出食管組織，取部分組織用液氮凍存后送北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進行表達譜芯片檢測，余下食管組織經(jīng) 4% 多聚甲醛固定后，送武漢谷歌生物科技有限公司按照病理實驗檢測 SOP 程序?qū)M織樣品進行 Notch1（1:100）免疫組化（IHC）染色，并將染色結(jié)果用全景切片掃描儀掃描保存，用 Aperio ImageScope 軟件對結(jié)果進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 CGA 下調(diào)經(jīng) 4-NQO 誘導(dǎo)的小鼠食管癌組織中 Notch1 的表達

本課題組在前期研究中已經(jīng)證實經(jīng) 4-NQO 誘導(dǎo)的自發(fā)性食管癌小鼠在接受50 mg/(kg?d) CGA治療后，其食管癌發(fā)生速度減緩，生存期比對照組小鼠有明顯的延長[6]。對該模型中的小鼠食管組織進行表達譜基因檢測尋找其中的差異基因，發(fā)現(xiàn) CGA 治療組小鼠食管組織中 Notch1 的表達低于對照組（圖1A），提示 Notch1 可能是 CGA 的調(diào)控靶點之一。對同一模型其余小鼠的食管組織進行 IHC 檢測 Notch1，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CGA 治療組小鼠食管組織中 Notch1 的表達明顯下降（圖1B）。采用分析軟件對 IHC 的染色結(jié)果進行量化分析，同樣證實 Notch1 的表達在兩組小鼠的食管組織中存在顯著差異（圖1C）。這些結(jié)果表明 CGA 能夠降低 4-NQO 誘導(dǎo)的自發(fā)性食管癌小鼠食管組織中 Notch1 的表達。

2.2 CGA 抑制體外培養(yǎng)的食管癌細胞中 Notch1 的表達

在 KYSE30、KYSE140、KYSE180 及 KYSE510細胞中加入不同濃度的 CGA（0、25、50、100、200 μmol/L）處理 48 h，收取細胞蛋白進行 Western blot 實驗。結(jié)果表明，4 種細胞中Notch1 的表達量均有不同程度的減少，隨著 CGA 濃度的增加，細胞中 Notch1 的表達受抑制的程度進一步增強（圖2），說明 CGA 能夠以劑量依賴的方式抑制體外培養(yǎng)的食管癌細胞中 Notch1 的表達。這一結(jié)果與 4-NQO 誘導(dǎo)的自發(fā)性小鼠食管癌模型中食管組織 IHC 染色的結(jié)果趨勢一致，說明 CGA 可以調(diào)節(jié)體內(nèi)、外食管癌細胞中 Notch1 的表達，換而言之，Notch1 可能是 CGA 的作用靶點之一。

圖1 CGA 對4-NQO 誘導(dǎo)的自發(fā)性食管癌小鼠食管組織內(nèi)Notch1 表達的影響（A：利用芯片檢測方法檢測食管組織中Notch1 的表達情況；B：IHC 染色檢測小鼠食管組織中Notch1 的表達；C：IHC 染色結(jié)果的定量分析；*P < 0.05）

Figure 1 The expression of Notch1 in esophagus tissues was down-regulated by CGA in 4-NQO induced ESCC murine model (A: The expression of Notch1 in esophagus tissues via microarray analysis; B: Representative photos of Notch1 expression in esophagus tissues by IHC staining; C: Quantitative analysis of IHC;*< 0.05)

2.3 敲降 Notch1 能減弱 CGA 對食管癌細胞的抑制作用

針對 Notch1 設(shè)計了兩條不同的 siRNA 序列，通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式將這兩條 siRNA 及 NC 分別轉(zhuǎn)入 KYSE30、KYSE140、KYSE180 及 KYSE510 細胞中，于轉(zhuǎn)染后 48 h 收取細胞 RNA 檢測 Notch1 的表達，結(jié)果表明這兩條 siRNA 均能顯著抑制細胞中 Notch1 的表達，抑制率在 50% 以上（圖3），說明這兩條 siRNA 能夠有效敲降食管癌細胞中的 Notch1 并開展進一步研究。本課題組在前期工作中已證實 CGA 能夠抑制 4 種食管癌細胞的克隆形成，及 KYSE30、KYSE140、KYSE180 細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[6]，根據(jù) 4 種細胞中 Notch1 受 CGA 抑制的程度高低（圖2B），我們將 4 種細胞分成 2 組，分別檢測敲降 Notch1 對食管癌細胞克隆形成能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

2.3.1 對食管癌細胞克隆形成能力的影響 分別在 KYSE180 和 KYSE510 細胞中瞬時轉(zhuǎn)入兩條不同的 siRNA 或者 NC，再用含有 CGA（50 μmol/L）或者不含 CGA 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 周，染色觀察克隆團形成的情況。與本課題組前期工作的結(jié)果一致，在轉(zhuǎn)染 NC 的 KYSE180 和 KYSE510 細胞中，用含 CGA 的培養(yǎng)基培養(yǎng)所形成的克隆團數(shù)目比用不含 CGA 的培養(yǎng)基培養(yǎng)所形成的克隆團數(shù)目明顯減少（圖4），說明 KYSE180 和KYSE510 細胞的克隆形成能力會受到 CGA 的抑制，而轉(zhuǎn)染 siRNA 的 KYSE180 和 KYSE510 細胞中，用含CGA 的培養(yǎng)基培養(yǎng)所形成的克隆團數(shù)與不含 CGA 的培養(yǎng)基培養(yǎng)所形成的克隆團數(shù)相差無幾（圖4），表明 Notch1 在 CGA 抑制食管癌細胞克隆形成的過程中發(fā)揮了重要的作用，Notch1 的表達降低能夠削弱 CGA 對食管癌細胞克隆形成能力的抑制作用。

圖2 Western blot 方法檢測給予不同濃度 CGA 處理的 4 種食管癌細胞中 Notch1 的表達情況（A：Western blot 檢測結(jié)果；B：對 Western blot 檢測結(jié)果的半定量分析）

Figure 2 Detection of the expression of Notch1 in four ESCC cell lines treated with different dose of CGA by Western blot

(A: Western blot analysis; B: The density scanning of Western blot)

圖3 qRT-PCR 檢測 4 種食管癌細胞系分別轉(zhuǎn)入兩條不同 siRNA 或 NC 序列后 Notch1 敲降的程度（A：KYSE30；B：KYSE140；C：KYSE180；D：KYSE510）

Figure 3 Ratio of knocking down Notch1 at mRNA level in four ESCC cell lines transfected with two different siRNAs or NC using qRT-PCR (A: KYSE30; B: KYSE140; C: KYSE180; D: KYSE510)

圖4 CGA 對敲降Notch1 的KYSE180 和KYSE510 細胞克隆形成的抑制作用（A：克隆形成的拍照結(jié)果；B：克隆形成比例；*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 4 Colony formation assays were performed to detect the inhibitory effect of CGA on Notch1 knocked-down KYSE180 and KYSE510 cells (A: Representatvie photographs; B: Percentage of formed colonies;*< 0.05,***< 0.001)

圖5 CGA 處理對敲降Notch1 的KYSE30 和KYSE140 細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

Figure 5 Representative micrographs of invading cells using Notch1 knocked-down KYSE30 and KYSE140 cells treated with CGA

2.3.2 對食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法，在 KYSE30 和 KYSE140 細胞中分別轉(zhuǎn)入兩條 siRNA 或者NC，轉(zhuǎn)染 12 h 后，加入 CGA（50 μmol/L）處理 24 h，再將細胞接種至預(yù)鋪有 Matrigel 膠的Transwell 小室中，24 h 之后染色觀察結(jié)果。結(jié)果表明，與不加 CGA 處理的細胞相比，轉(zhuǎn)染 NC 的 KYSE30 和 KYSE140 細胞，在經(jīng)過 CGA 處理 24 h 后，侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱（圖5），說明 CGA 的確可以抑制 KYSE30 和 KYSE140 細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)染 siRNA 的 KYSE30 和 KYSE140 細胞，其侵襲轉(zhuǎn)移能力并未受到 CGA 的影響（圖5），說明敲降 Notch1 之后，KYSE30 和 KYSE140 細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力不再受到 CGA 的抑制，換而言之，Notch1 能夠調(diào)控食管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，CGA 通過抑制Notch1 的表達從而抑制食管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

通過上述克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移實驗，證實了 CGA 對食管癌細胞的克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移能力均有抑制作用，而在敲降細胞中的 Notch1 之后，該抑制作用減弱消失，說明 Notch1 是 CGA 的作用靶點，CGA 通過調(diào)控 Notch1 進而影響食管癌細胞的克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移。

3 討論

食管癌是高度惡性的消化道腫瘤之一，其 5 年生存率僅為 20% 左右，以外科手術(shù)治療為主的各種治療手段并不能有效改善食管癌，尤其是晚期食管癌的預(yù)后，延長食管癌患者的生存期[7]。由于食管生理解剖位置的隱蔽性，食管癌早期癥狀不明顯，多數(shù)食管癌患者就診時已處于中晚期，手術(shù)可切除率低，現(xiàn)有的放化療治療手段效果欠佳、副作用大[8]，亟需尋找開發(fā)新的食管癌治療藥物，尤其是針對中晚期食管癌。CGA 是金銀花、杜仲等許多中草藥的主要有效成分之一，具有廣泛的生物學活性，在抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等方面發(fā)揮作用[9]。在我國，已將 CGA 作為抗腫瘤藥物用于治療晚期復(fù)發(fā) IV 級膠質(zhì)母細胞瘤 II/III 期臨床研究（CTR20181644）。本課題組在前期工作中已經(jīng)證實 CGA 能夠抑制體內(nèi)、外食管癌細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，同時延長 4-NQO 誘導(dǎo)的自發(fā)性食管癌小鼠的生存期[6]，表明 CGA 同樣具有良好的抗食管癌效果。然而，作為小分子天然活性產(chǎn)物，CGA 具有多靶點、多作用機制的特性[9]，在不同種類腫瘤中的具體作用靶點和分子機制并未明確，需要深入探討研究。

Notch1 是 Notch 蛋白家族成員之一，具有高度的保守性，在脊椎動物和非脊椎動物中廣泛存在。Notch1 參與的信號通路在許多基本的生物學進程和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了十分重要的作用，因此它的異?？梢灾苯訉?dǎo)致多種人類疾病，從各種發(fā)育綜合征（如脊椎肋骨發(fā)育不全、并指等）到各種成人疾病（如腫瘤、阿爾茨海默病等）等[3]。由于 Notch1 所介導(dǎo)的信號通路具有細胞組織背景依賴的特性[10]，盡管有大量研究報道 Notch1 的異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在腫瘤中的具體作用依舊不明確，既可以作為原癌基因發(fā)揮促癌作用，又可以作為抑癌基因發(fā)揮抑癌作用，其具體作用取決于不同的腫瘤類型，或者同一腫瘤的不同亞型[4, 10-14]。在食管癌中，多個研究團隊針對不同地區(qū)來源的食管癌組織進行高通量測序后均發(fā)現(xiàn)，編碼 Notch1 蛋白的1 基因在食管癌組織中常常出現(xiàn)無意義突變或者擴增[5, 15-18]，提示 Notch1 可以作為食管癌的一個分子標志物。同時，Notch1表達量的高低也與食管癌的分化程度和生存預(yù)后密切相關(guān)，高表達 Notch1 的食管癌患者的生存期明顯縮短[19-20]。另外一項針對 4-NQO 誘導(dǎo)的自發(fā)性食管癌小鼠模型的研究表明，與正常對照小鼠相比，食管癌小鼠組織中 Notch1 的表達量明顯升高，并且其表達量隨著食管癌的發(fā)生發(fā)展進程不斷增加[21]，這些研究均表明 Notch1 在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。在本實驗中，通過對 4-NQO 誘導(dǎo)的自發(fā)性食管癌小鼠模型中的食管組織進行表達譜分析找出其中的差異基因，發(fā)現(xiàn) Notch1 在對照組和 CGA 治療組中的表達存在明顯差異，并且通過 IHC 染色及 qRT-PCR 實驗證實了這一差異的存在，提示 Notch1 的表達下調(diào)與 CGA 抑制食管癌密切相關(guān)。

腫瘤細胞干性和自我更新能力在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮了重要的作用，克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移能力則是體現(xiàn)腫瘤細胞干性的其中兩個特征[22]。研究表明，Notch1 及其介導(dǎo)參與的信號通路能夠調(diào)控食管癌細胞的克隆和侵襲轉(zhuǎn)移，進而影響食管癌細胞的干性[21, 23]。本課題組前期工作已經(jīng)證實 CGA 能夠抑制食管癌細胞的增殖、克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移這幾個腫瘤細胞干性的特征，這一抑制作用與調(diào)節(jié)食管癌細胞內(nèi)干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 SOX2、Bmi1 的表達相關(guān)[6]。作為小分子天然化合物，CGA 的作用靶點與作用機制并不唯一，因此，在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，本實驗發(fā)現(xiàn) Notch1 在 CGA 抑制食管癌細胞的克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移過程中同樣發(fā)揮了重要的作用，提示Notch1 是 CGA 抑制食管癌的另外一個作用靶點。然而，在 CGA 針對食管癌細胞發(fā)揮抑制作用的過程中，Notch1 和SOX2、Bmi1 之間是否存在聯(lián)系或者交叉作用，除了對食管癌細胞克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移的作用之外，Notch1 與 SOX2、Bmi1 對 CGA 調(diào)節(jié)食管癌細胞其他干性特征，如放化療抵抗等方面是否同樣發(fā)揮作用，以及它們的具體調(diào)控機制仍然有待進一步的研究和探討。

盡管 Notch1 在腫瘤中的具體作用還有待進一步明確，針對能夠下調(diào) Notch1 表達的抗腫瘤和化療增敏藥物的研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物能發(fā)揮減少腫瘤干細胞亞群數(shù)量，從而達到抗腫瘤的作用[4]，提示 Notch1 也可以作為臨床抗腫瘤藥物研發(fā)的一個不錯的靶點。圍繞 Notch1 及其介導(dǎo)的信號通路中的分子作為臨床抗腫瘤治療靶點的可行性研究已有大量開展[24-26]。使用 Notch1 的抑制劑，例如Notch1 單克隆抗體、Notch1 siRNA、γ-分泌酶抑制劑、天然產(chǎn)物等，能夠在不同腫瘤階段發(fā)揮抗癌作用[4]。這其中被研究最多的是 γ-分泌酶，其能夠?qū)е?Notch 介導(dǎo)的信號通路的失活，目前已有臨床研究開展探討分泌酶抑制劑的單用和聯(lián)用治療腫瘤的效果[27-29]。本研究已經(jīng)證實 Notch1 是 CGA 發(fā)揮抗食管癌作用的靶點之一，能夠影響食管癌細胞的克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移，提示 Notch1 作為抗食管癌藥物研究靶點是具有可行性的，為進一步闡述 CGA 治療食管癌的分子作用機制，以及臨床抗食管癌藥物的研發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

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Chlorogenic acid suppresses colony formation and invasion of esophageal squamous cell carcinoma via down-regulating the expression of Notch1

ZHAN Yun, LI Rui, JIANG Jian-dong, HAN Yan-xing

Author Affiliations: State Key Laboratory of Bioactive Substances and Function of Natural Medicine, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

This study aims to investigate the effect and mechanism of Notch1 in the process of chlorogenic acid (CGA) suppressing esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).Microarray assay was performed to detect the different genes in esophagus tissues of ESCC murine model treated with CGA, and immunohistochemistry (IHC) was used for verification. Different ESCC cell lines were treated with CGA, and the expression of Notch1 in these cells was detected by Western blot. RNAi was used to knock down Notch1 in ESCC cells before adding CGA treatment, then the colony formation assay and Transwell invasion assay were performed to detect the capabilities of colony formation and invasion in these cells, respectively.Microarray assay analysis showed that the expression of Notch1 in esophagus tissues was down-regulated in mice treated with CGA, which was confirmed by IHC staining. Inhibition of Notch1 expression in different ESCC cell lines was observed by Western blot, and the inhibitory effect was gradually enhanced with the increase of CGA concentration.Using RNAi technology to knock down Notch1 in ESCC cells and adding CGA to perform colony formation assay and Transwell invasion assay, the results showed that the number of colonies formed and cells invaded by CGA treatment was much lower than that of the control group in ESCC cells that normally express Notch1. However, in Notch1 knocked-down ESCC cells, no significant difference of the number of either colonies formed or cells invaded was observed after the treatment of CGA.Notch1 is one target of CGA, and CGA inhibits the capabilities of colony formation and invasion of ESCC cells by acting on Notch1.

chlorogenic acid; Notch1; esophageal carcinoma; colony formation; invasion

HAN Yan-xing, Email: hanyanxing@imm.ac.cn

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2018ZX09711001- 003-001）；協(xié)和青年科研基金（3332015165）

韓燕星，Email：hanyanxing@imm.ac.cn

2021-01-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.002