盧 豪，占穩(wěn)穩(wěn)，熊國(guó)平，吳汝芳，胡曉繼，韓迎燕，李 莉，張慶華

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病年齡逐漸呈年輕化，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。子宮頸癌的發(fā)病涉及遺傳、病毒感染等多種因素，盡管子宮頸癌的治療已取得較大進(jìn)展，子宮頸癌細(xì)胞的高增殖性和侵襲性嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[2-3]。近年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療成為子宮頸癌分析的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)參與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[4]。LncRNA是通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的分化、增殖、侵襲、凋亡、衰老等生物學(xué)過程[5-6]。研究顯示，LncRNA SLC16A1-AS1在肺癌、肝癌等腫瘤組織中表達(dá)降低，過表達(dá)SLC16A1-AS1可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。目前，SLC16A1-AS1在子宮頸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)子宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)著重探討SLC16A1-AS1在子宮頸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)，分析其靶向miR-15a-5p與子宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)系，為臨床子宮頸癌的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集2018年3月～2020年8月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院婦產(chǎn)科33例子宮頸癌根治術(shù)標(biāo)本，患者年齡41～69歲，平均(49.31±7.87)歲。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecologyand Obstetrics, FIGO)分期：I期12例，Ⅱ期10例，Ⅲ期11例；組織分化程度：低分化14例，中分化19例?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療或生物治療。新鮮組織標(biāo)本儲(chǔ)存于液氮罐中。另選同期因子宮肌瘤行全子宮切除標(biāo)本，并經(jīng)病理證實(shí)無子宮頸病變者作為對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞及試劑人正常子宮頸上皮細(xì)胞H8和子宮頸癌細(xì)胞株HeLa、HCC94、SiHa、C33A，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。陰性質(zhì)粒(NC)、SLC16A1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒、miR-NC、miR-15a-5p模擬物、SLC16A1-AS1野生型質(zhì)粒(SLC16A1-AS1-WT)、SLC16A1-AS1突變體質(zhì)粒(SLC16A1-AS1-MUT)，均購(gòu)自廣州銳博生物公司。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。MTT試劑盒購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技公司。qRT-PCR引物由上海生物公司合成。Lipofectamine 3000、Matrigel基質(zhì)膠，均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物公司。GAPDH、PCNA、N-cadherin、Slug、Ki-67蛋白抗體，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(蛋白編號(hào)分別為ab8245、ab29、ab76011、ab27568、ab16667)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染HeLa、HCC94、SiHa細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，H8、C33A細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在24孔板中培養(yǎng)C33A細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用Lipofectamine 3000試劑將NC、SLC16A1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至C33A細(xì)胞，標(biāo)記為NC組和SLC16A1-AS1組。轉(zhuǎn)染8 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)SLC16A1-AS1和miR-15a-5p表達(dá)在不同子宮頸組織或細(xì)胞中加入Trizol裂解液，提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH、U6為SLC16A1-AS1和miR-15a-5p的內(nèi)參基因，配制20 μL的qRT-PCR反應(yīng)體系，上、下游引物各1 μL(表1)。以2-ΔΔCt法分析計(jì)算SLC16A1-AS1和miR-15a-5p的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 MTT法檢測(cè)C33A細(xì)胞的增殖胰酶消化NC組和SLC16A1-AS1組C33A，以每孔200 μL接種至96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。在接種后第24、48、72、96、120 h分別加入MTT試劑20 μL，培養(yǎng)3 h。每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩器震蕩15 min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)C33A細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C33A細(xì)胞的侵襲能力將Matrigel基質(zhì)膠與無血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1 ∶2混勻，置于Transwell小室上室。胰酶消化NC組和SLC16A1-AS1組C33A細(xì)胞，使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸以每孔200 μL接種至Transwell小室上室；每孔2×104個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，用棉簽擦去未穿過細(xì)胞，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色。采用流水清洗并晾干，在100倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SLC16A1-AS1的靶基因采用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0，預(yù)測(cè)SLC16A1-AS1可能的靶向miRNA。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C33A細(xì)胞至24孔板，分別共轉(zhuǎn)染SLC16A1-AS1-WT+miR-NC、SLC16A1-AS1-WT+miR-15a-5p、SLC16A1-AS1-MUT+miR-NC和SLC16A1-AS1-MUT+miR-15a-5p。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒說明書，檢測(cè)各組C33A細(xì)胞的相對(duì)熒光酶活性。

1.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)采用細(xì)胞裂解液提取NC組和SLC16A1-AS1組C33A細(xì)胞總蛋白，每組按40 μg上樣量進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳(110 V恒壓)，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(200 mA恒流)，在5%脫脂牛奶中封閉3 h。一抗均按1 ∶2 000比例稀釋，聚偏二氟乙烯膜在冰箱內(nèi)一抗孵育過夜。二抗均按1 ∶5 000比例稀釋，聚偏二氟乙烯膜在室溫二抗孵育1.5 h。滴加電化學(xué)發(fā)光顯影液進(jìn)行顯影，在凝膠成像儀中顯影并采集圖片，用GADPH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌和癌旁組織中SLC16A1-AS1的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，子宮頸癌組織和癌旁組織中SLC16A1-AS1的表達(dá)水平分別為1.63±0.31和7.35±0.48，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 子宮頸癌組織和癌旁組織中SLC16A1-AS1的表達(dá)水平：與癌旁組織相比，**P<0.01

2.2 子宮頸癌細(xì)胞株和正常子宮頸上皮細(xì)胞中SLC16A1-AS1表達(dá)水平qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常子宮頸上皮細(xì)胞H8相比，子宮頸癌細(xì)胞株HeLa、HCC94、SiHa、C33A中SLC16A1-AS1的表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。本組選擇表達(dá)水平最低的C33A細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 子宮頸癌細(xì)胞株和正常子宮頸上皮細(xì)胞中SLC16A1-AS1的表達(dá)水平：與H8細(xì)胞相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 SLC16A1-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證NC組和SLC16A1-AS1組的C33A細(xì)胞中，SLC16A1-AS1表達(dá)水平分別為1.06±0.19和9.92±1.04。與NC組相比，SLC16A1-AS1組的C33A細(xì)胞中SLC16A1-AS1的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。

2.4 過表達(dá)SLC16A1-AS1對(duì)C33A細(xì)胞增殖能力的影響MTT結(jié)果顯示，與NC組相比，SLC16A1-AS1組中C33A細(xì)胞的吸光度(A)值24 h后下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。本組結(jié)果提示過表達(dá)SLC16A1-AS1能抑制C33A細(xì)胞的增殖能力。

圖3 過表達(dá)SLC16A1-AS1對(duì)C33A細(xì)胞增殖的影響：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5 過表達(dá)SLC16A1-AS1對(duì)C33A細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組和SLC16A1-AS1組中C33A細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(107.10±13.17)個(gè)和(41.76±11.12)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。本組結(jié)果提示過表達(dá)SLC16A1-AS1可抑制C33A細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 過表達(dá)SLC16A1-AS1對(duì)C33A細(xì)胞侵襲的影響：A.Transwell侵襲圖；B.細(xì)胞侵襲數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，與NC組相比，**P<0.01

2.6 SLC16A1-AS1靶向結(jié)合miR-15a-5pstarBase v2.0預(yù)測(cè)網(wǎng)站顯示：SLC16A1-AS1可能的靶基因是miR-15a-5p(圖5)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示：與SLC16A1-AS1-WT+miR-NC組相比，miR-15a-5p可明顯下調(diào)SLC16A1-AS1-WT質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性(P<0.01)。對(duì)特異性結(jié)合區(qū)域點(diǎn)突變后，與SLC16A1-AS1-MUT+miR-NC組相比，miR-15a-5p不能抑制SLC16A1-AS1-MUT質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性(P>0.05，圖6)，提示SLC16A1-AS1可與miR-15a-5p特異性結(jié)合。

圖5 SLC16A1-AS1與miR-15a-5p結(jié)合預(yù)測(cè)圖

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SLC16A1-AS1靶向結(jié)合miR-15a-5p：與SLC16A1-AS1-WT+miR-NC組相比，**P<0.01

2.7 各組C33A細(xì)胞中miR-15a-5p的表達(dá)NC組和SLC16A1-AS1組中C33A細(xì)胞的miR-15a-5p表達(dá)水平分別為1.02±0.06和0.19±0.04。與NC組相比，SLC16A1-AS1組C33A細(xì)胞中miR-15a-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，提示SLC16A1-AS1可靶向抑制miR-15a-5p的表達(dá)。

2.8 過表達(dá)SLC16A1-AS1對(duì)增殖和侵襲相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示：與NC組相比，轉(zhuǎn)染SLC16A1-AS1后，C33A細(xì)胞的增殖表型蛋白如PCNA、Ki-67表達(dá)降低，C33A細(xì)胞的侵襲表型蛋白如N-cadherin、Slug表達(dá)降低(圖7)。

圖7 Western blot法檢測(cè)SLC16A1-AS1對(duì)增殖和侵襲相關(guān)表型蛋白表達(dá)的影響

3 討論

LncRNA屬于內(nèi)源性非編碼RNA，經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄合成[8-11]。LncRNA雖然不具有編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，其可通過影響靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程[12-17]。 研究證實(shí)，LncRNA如MIR22HG、LINC01305、EWSAT1被發(fā)現(xiàn)在子宮頸癌組織中表達(dá)明顯異常，與子宮頸癌患者的放療敏感性、預(yù)后等密切相關(guān)[18-21]。Liu等[7]報(bào)道SLC16A1-AS1在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞株中明顯下調(diào)，過表達(dá)SLC16A1-AS1可抑制肺癌細(xì)胞的活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；SLC16A1-AS1表達(dá)水平較高的患者總生存期和無進(jìn)展生存期更長(zhǎng)。Pei等[22]報(bào)道SLC16A1-AS1在肝癌組織和細(xì)胞中明顯下調(diào)，SLC16A1-AS1過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放療敏感性。SLC16A1-AS1表現(xiàn)為明顯的抑癌基因作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮頸癌組織中SLC16A1-AS1的表達(dá)水平低于子宮頸正常組織，子宮頸癌細(xì)胞株中SLC16A1-AS1的表達(dá)水平低于正常子宮頸上皮細(xì)胞，提示其可能參與調(diào)控子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選SLC16A1-AS1表達(dá)最低的C33A細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，過表達(dá)SLC16A1-AS1后，C33A細(xì)胞的增殖和侵襲能力均明顯降低，提示SLC16A1-AS1在子宮頸癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。

LncRNA屬于線性RNA，可通過海綿吸附作用結(jié)合miRNA，有效抑制miRNA的表達(dá)[23-27]。生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)顯示，SLC16A1-AS1與miR-15a-5p有特異性結(jié)合位點(diǎn)，miR-15a-5p可能是SLC16A1-AS1的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-15a-5p是SLC16A1-AS1的靶基因。miR-15a-5p屬于miR-15a家族的一員，在胃癌、卵巢癌、腎癌等組織中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，發(fā)揮癌基因的作用[28-29]。miR-15a-5p在子宮頸癌組織和細(xì)胞株中均呈高表達(dá)，抑制miR-15a-5p表達(dá)可顯著降低子宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[30]。本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SLC16A1-AS1可負(fù)向調(diào)控miR-15a-5p的表達(dá)。以上結(jié)果表明，SLC16A1-AS1通過下調(diào)miR-15a-5p的表達(dá)，抑制子宮頸癌C33A細(xì)胞的增殖和侵襲。Western blot結(jié)果顯示，SLC16A1-AS1降低miR-15a-5p表達(dá)后，C33A細(xì)胞的增殖表型蛋白如PCNA、Ki-67表達(dá)降低，C33A細(xì)胞的侵襲表型蛋白如N-cadherin、Slug表達(dá)降低，間接表明子宮頸癌C33A細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降。

綜上所述，SLC16A1-AS1在子宮頸癌組織及細(xì)胞株中低表達(dá)，SLC16A1-AS1可通過靶向負(fù)調(diào)控miR-15a-5p表達(dá)，抑制子宮頸癌C33A細(xì)胞的增殖和侵襲能力。SLC16A1-AS有望成為子宮頸癌治療的靶點(diǎn)。