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乳腺癌中肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的表達(dá)及臨床病理意義

2021-06-17 12:20王志皓盛有璟彭煒東
關(guān)鍵詞:亞型B型免疫組化

王志皓,盛有璟,彭煒東,吳 強(qiáng),

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,也是全球女性癌癥死亡的主要原因。截至2020年,全球乳腺癌新發(fā)病例230萬,占女性新發(fā)惡性腫瘤的11.7%,其死亡人數(shù)占女性死亡病例的6.9%[1]。乳腺癌根據(jù)受體類型不同分為四種亞型:Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型和三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)[2]。非三陰型乳腺癌(non-triple negative breast cancer, non-TNBC)的治療方法以內(nèi)分泌治療或抗HER-2靶向治療為主,再輔以化療,患者預(yù)后良好。TNBC是一組ER、PR及HER-2均為陰性的乳腺癌,與non-TNBC相比,其發(fā)病年齡早,復(fù)發(fā)率較高[3-5]。目前,TNBC由于缺乏藥物靶向受體,治療效果不甚理想,國際推薦全身化療為首選治療方案[6]。根據(jù)TNBC分子亞型的不同,化療方案的組合繁多,預(yù)后差異較大[7-10]。因此,探索預(yù)測乳腺癌治療的生物學(xué)標(biāo)志物,對乳腺癌特別是TNBC有重要意義。肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(peptide transporter 1,PEPT1)屬于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,最早被發(fā)現(xiàn)在小腸黏膜組織中高表達(dá),其介導(dǎo)寡肽吸收并可促進(jìn)藥物吸收[11]。近年,PEPT1在消化、呼吸和泌尿系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)及作用受到關(guān)注[12-15],但在乳腺癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性未見報(bào)道。本文采用免疫組化MaxVision法檢測乳腺癌中PEPT1的表達(dá),探討其與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,為預(yù)測臨床療效提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014~2018年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的80例女性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌手術(shù)組織蠟塊、40例癌旁正常乳腺手術(shù)組織蠟塊,術(shù)前均未進(jìn)行放、化療?;颊咧形荒挲g50.0歲(31~80歲);腫瘤中位直徑3.0 cm(0.5~7.0 cm)。根據(jù)WHO(2019)乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)分類、分級[16],其中Ⅰ級16例、Ⅱ級35例、Ⅲ級29例。根據(jù)第八版美國癌癥聯(lián)合會(the American Joint Committee on Cancer, AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[17],所有病理切片均經(jīng)兩位主治及以上病理醫(yī)師共同閱片,ER、PR、HER-2及Ki-76的數(shù)據(jù)均來源于既往病理學(xué)報(bào)告的復(fù)核數(shù)據(jù)。術(shù)后根據(jù)分子亞型接受不同方案的全身系統(tǒng)性治療:Luminal型內(nèi)分泌治療+化療,HER-2過表達(dá)型靶向抗HER-2+化療,TNBC僅化療。術(shù)后隨訪6~80個(gè)月,患者有復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、死亡或失聯(lián)時(shí)截止。

1.2 主要試劑兔抗人Anti-SLC15A1/PEPT1多克隆抗體(克隆號:ab78020),購自Abcam公司。酶標(biāo)山羊抗小鼠/抗兔IgG聚合物(通用型)、PBS磷酸緩沖鹽粉末、檸檬酸鈉緩沖液粉末、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑及DAB顯色液,均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析 登錄TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(http://timer.comp-genomics.org/),檢索PEPT1 mRNA在乳腺癌和正常乳腺組織中的相對表達(dá)量。登錄Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=background),分析 PEPT1 mRNA表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.3.2免疫組化 采用免疫組化MaxVision法染色檢測PEPT1的表達(dá)。切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)后,4 ℃過夜孵育一抗,孵育二抗后DAB顯色,蘇木精復(fù)染后,脫水,透明,封固。

1.4 結(jié)果判讀本實(shí)驗(yàn)采用半定量法進(jìn)行判斷,PEPT1以棕黃、棕褐染色顆粒定位于細(xì)胞膜為陽性。(1)根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分:無著色為0分,淺黃色為1分,淺棕色為2分,棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計(jì)分:無陽性細(xì)胞為0分,1%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,76%~100%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘:0~2分為不表達(dá),3~5分為低表達(dá),6分及以上為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,樣本率組間比較采用χ2檢驗(yàn),F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)分析相關(guān)性,采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫PEPT1 mRNA在正常乳腺組織和乳腺癌不同分子亞型中的表達(dá)采用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫,分析1 093例浸潤性乳腺癌和112例正常乳腺組織中PEPT1 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示:PEPT1 mRNA在正常乳腺和乳腺癌組織中的表達(dá)差異有顯著性(P<0.001);在Luminal A、Luminal B型乳腺癌中稍低于正常乳腺組織。PEPT1 mRNA在HER-2過表達(dá)型、TNBC中明顯高于正常乳腺組織,TNBC的PEPT1相對表達(dá)量在乳腺癌的四種分型中最高(圖1)。

圖1 PEPT1 mRNA在正常乳腺組織和乳腺癌四種分子亞型中的表達(dá)

2.2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中PEPT1的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析PEPT1表達(dá)與乳腺癌四種亞型患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示:Luminal A、Luminal B型及TNBC中PEPT1高表達(dá),患者20年無復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival, RFS)明顯高于低表達(dá)者(HR=0.7,95%CI0.59~0.83vsHR=0.65,95%CI0.52~0.8vsHR=0.73,95%CI0.58~0.91);HER-2過表達(dá)型PEPT1表達(dá)與20年RFS無明顯相關(guān)性(圖2)。

圖2 PEPT1的表達(dá)與乳腺癌四種亞型患者RFS的關(guān)系:A.Luminal A型;B.Luminal B型;C.HER-2型;D.TNBC

2.3 乳腺癌及癌旁正常組織中PEPT1的表達(dá)本組采用免疫組化MaxVison法對80例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌石蠟包埋組織和40例癌旁正常組織進(jìn)行PEPT1蛋白檢測。PEPT1陽性染色顆粒主要定位于癌細(xì)胞及少數(shù)乳腺上皮細(xì)胞,37例細(xì)胞核呈彌漫陽性,其中4例同時(shí)可見胞質(zhì)弱陽性。45例癌旁組織中4例高表達(dá),占8.9%;80例乳腺癌患者中33例PEPT1高表達(dá),占41.2%。乳腺癌中PEPT1高表達(dá)顯著升高(P<0.000 1,表1,圖3)。乳腺癌四種分子亞型中PEPT1的高表達(dá)占比存在明顯差異,TNBC(65.7%)明顯高于non-TNBC(22.2%)(表2)。

圖3 癌旁正常組織、乳腺癌組織中PEPT1 的表達(dá),MaxVision法:A.癌旁正常組織中PEPT1呈陰性;B.部分乳腺癌組織中PEPT1呈胞核彌漫陽性;C.部分乳腺癌組織中PEPT1呈陰性

表1 癌旁正常組織和乳腺癌組織中PEPT1的表達(dá)[n (%)]

表2 PEPT1的表達(dá)與乳腺癌分子分型的相關(guān)性

2.4 乳腺癌中PEPT1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組結(jié)果顯示:PEPT1高表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.03)呈負(fù)相關(guān)。PEPT1高表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級及ER、PR、HER-2表達(dá)、Ki-67增殖指數(shù)均無相關(guān)性(P>0.05,表3)。

表3 乳腺癌中PEPT1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n (%)]

2.5 PEPT1表達(dá)與乳腺癌不同分子亞型患者預(yù)后的關(guān)系本組80例乳腺癌患者中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或死亡的患者合計(jì)34例,占42.5%。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,PEPT1高表達(dá)與術(shù)后化療的TNBC患者3年無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)呈顯著的正相關(guān)(P<0.01,圖4)。PEPT1的高表達(dá),與Luminal A、Luminal B型和HER-2過表達(dá)型患者3年P(guān)FS無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

圖4 TNBC患者PEPT1高表達(dá)與術(shù)后化療后PFS的相關(guān)性:A.Kaplan-Meier生存分析;B.直方圖

3 討論

PEPT1屬于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,是細(xì)胞吸收蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的重要介質(zhì)[11]。近年,PEPT1在不同腫瘤中的表達(dá)及作用被相繼報(bào)道。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PEPT1在前列腺癌、膀胱癌、胃癌和肝癌細(xì)胞中表達(dá)增多[12-15],推測其表達(dá)增加可能與腫瘤細(xì)胞高代謝特性有相關(guān)性。Gong等[15]利用肝癌細(xì)胞PEPT1高表達(dá)的特性,把PEPT1作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體,將阿霉素靶向傳遞至肝癌細(xì)胞內(nèi),增加其抗腫瘤效果。Huo等[18]報(bào)道前列腺癌細(xì)胞系PC3和腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U118中,PEPT1可轉(zhuǎn)運(yùn)褪黑激素到腫瘤細(xì)胞的線粒體內(nèi),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,提示PEPT1可提高褪黑素的療效。我們利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織和乳腺癌不同亞型的PEPT1表達(dá)量具有差異性,TNBC中PEPT1表達(dá)量明顯高于non-TNBC和正常乳腺組織。PEPT1在Luminal型乳腺癌中和正常乳腺組織表達(dá)量差值較少,推測可能由于Luminal型乳腺癌生物學(xué)行為較為惰性,腫瘤在某些代謝水平可能與正常細(xì)胞相近,故PEPT1表達(dá)量較為接近,本研究后續(xù)將設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究兩者的詳細(xì)機(jī)制。本組采用免疫組化MaxVision法檢測80例乳腺癌患者中PEPT1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNBC中PEPT1高表達(dá)者占65.7%,明顯高于癌旁正常組織(8.9%)和non-TNBC(22.2%)。PEPT1的高表達(dá)與乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05);與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級及ER、PR、HER-2表達(dá)、Ki-67增殖指數(shù)均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。本組結(jié)果提示,PEPT1在乳腺癌和癌旁正常組織中表達(dá)差異,可能與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)。

目前,PEPT1表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后生存的關(guān)系尚未見報(bào)道。本組結(jié)合免疫組化檢測和隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn),PEPT1高表達(dá)的TNBC患者術(shù)后化療效果較好,≥3年P(guān)FS患者的PEPT1高表達(dá)組高于不表達(dá)+低表達(dá)組(67%vs40%)。PEPT1高表達(dá)與患者3年P(guān)FS有顯著相關(guān)性(P<0.01),提示PEPT1的表達(dá)與TNBC患者預(yù)后相關(guān),且PEPT1高表達(dá)者的預(yù)后優(yōu)于不表達(dá)+低表達(dá)者。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果一致。數(shù)據(jù)庫分析表明PEPT1高表達(dá)的Luminal型乳腺癌20年RFS更佳,本組隨訪結(jié)果顯示其與患者3年P(guān)FS無相關(guān)性,可能與Luminal型預(yù)后佳、生存期長且PEPT1高表達(dá)占比低有關(guān)。因此,需進(jìn)一步隨訪并積累更多該分子亞型病例加以驗(yàn)證。

本組發(fā)現(xiàn)PEPT1高表達(dá)與乳腺癌不同分子亞型患者預(yù)后的關(guān)系不一致,其是否與不同分子亞型全身治療方案的差異有關(guān)還需進(jìn)一步分析。2019年第16屆圣加侖國際乳腺癌大會指出:依據(jù)乳腺癌分子亞型制定針對性治療方案,可顯著改善乳腺癌患者的預(yù)后[19]。對激素受體陽性乳腺癌患者采用內(nèi)分泌治療即可獲得較為良好的預(yù)后,僅少部分患者可從增加化療中獲益[20-22]。HER-2靶向抗體特異性作用于腫瘤細(xì)胞表面HER-2受體,極大改善了HER-2過表達(dá)患者的預(yù)后[19]?;熥鳛榻?jīng)典的系統(tǒng)治療手段,可見于大部分的乳腺癌治療方案中,也是TNBC唯一療效明顯的全身治療方法[6]。多項(xiàng)研究評估乳腺癌不同分子亞型的化療療效,雖然TNBC單純化療的療效較為有限,但是對純化療的敏感性比non-TNBC稍高[23-25]。Prat等[26]評估451例新輔助化療乳腺癌患者的病理完全緩解(pathologic complete response,pCR)率,結(jié)果顯示Luminal A、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型和TNBC中pCR率分別為5%、15%、16%和36%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Prat等[25]還分析180例接受新輔助化療乳腺癌患者的穿刺活檢病理報(bào)告,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Luminal A、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型和TNBC殘余腫瘤負(fù)荷(residual cancer burden, RCB)評級為0/1的占比分別為9.3%、20.0%、14.3%和50.0%。兩項(xiàng)研究結(jié)果均顯示TNBC比non-TNBC對化療藥物有更好療效。本實(shí)驗(yàn)通過數(shù)據(jù)庫及免疫組化檢測不同亞型乳腺癌中PEPT1的表達(dá),結(jié)果顯示:TNBC中PEPT1高表達(dá)者高于non-TNBC,且TNBC中高表達(dá)PEPT1患者術(shù)后化療明顯優(yōu)于不表達(dá)+低表達(dá)者。因此,我們推測PEPT1的表達(dá)可能與TNBC化療療效有關(guān),其高表達(dá)與化療效果的相關(guān)性可作為后續(xù)分析的重點(diǎn)。

綜上所述,本組首次探討PEPT1在乳腺癌不同分子亞型中的表達(dá)差異,結(jié)果表明PEPT1高表達(dá)與TNBC患者化療預(yù)后關(guān)系密切,有望成為預(yù)測TNBC患者療效的新生物學(xué)指標(biāo)。

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