許 靜，徐玲玲，張夢琦

(植物與微生物協(xié)同研究實驗室，西安文理學院 生物與環(huán)境工程學院，陜西 西安 710065)

前言

吡蟲啉是德國拜耳公司在20世紀八十年代研發(fā)的一種高效低毒殺蟲劑, 對刺吸式口器害蟲如蚜蟲和葉蟬及鞘翅目害蟲有非常好的防治效果，目前已在超過80 個國家的60 種農作物上使用, 年使用量高達1 000～30 000 t，世界銷售額達9.2億美元[1，2]。作為一種硝基亞甲基類氯代尼古丁殺蟲劑，吡蟲啉作用于昆蟲的煙酸乙酰膽堿酶受體的作用體，通過干擾昆蟲的神經(jīng)刺激傳導系統(tǒng),使煙堿酶受體的神經(jīng)通路梗阻，進而破壞其神經(jīng)系統(tǒng)，致使昆蟲麻痹，并最終導致昆蟲死亡[2]。吡蟲啉具有觸殺、胃毒和內吸等多重作用，所以無論害蟲吸食或者接觸都可有效防治。有意思的是，除了殺蟲外，儀美芹等人[3]研究表明吡蟲啉還可以提高番茄的過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性，從而提高植物根系活力。另外，劉中良等人[4]研究表明吡蟲啉在適宜濃度下可以促進番茄的生長進而提高其逆境屏蔽效應。值得注意的是，還有研究表明吡蟲啉可以誘導植物的系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)，從而增強植物對病原菌的抗性[5，6]。這些研究說明吡蟲啉可以直接作用于植物，促進其生理生長并增加其對生物逆境或非生物逆境的抗性。但是，目前還未有報道吡蟲啉是否可以直接作用于病原菌的生長繁殖。因此，筆者以一種能引起眾多植物病害的病原性真菌鏈格孢菌(Alternariaalternata)為研究對象，檢測了吡蟲啉對其菌絲生長和形態(tài)以及產孢子的作用，揭示了吡蟲啉對植物病原真菌生長繁殖的影響，探討其用于植物抗病的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及培養(yǎng)

所用鏈格孢菌來源于西北師范大學馬宗旺博士的饋贈。鏈格孢菌培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g·L-1, 葡萄糖20 g·L-1， 瓊脂15 g·L-1)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。

1.2 吡蟲啉的使用

吡蟲啉粉劑購于Dr Ehrenstorfer GmbH。用甲醇溶解配制成10 g·L-1的母液，用0.22 μm無菌過濾器過濾滅菌后置于-20℃保存。使用時先室溫解凍，然后按濃度稀釋比例加入50℃左右培養(yǎng)基中，混勻后倒平板，待平板冷卻凝固后使用。

1.3 菌絲生長速度和形態(tài)的檢測

菌種在PDA培養(yǎng)基上活化后，用直徑為1 cm的打孔器取邊緣菌絲瓊脂塊，置于平板中心后培養(yǎng)，每隔兩天用十字交叉法測量菌落生長直徑，直到長滿整個平板。

待長出新鮮菌絲后，每隔兩天在超凈臺下用接種針挑取少量菌絲在滴有一滴滅菌蒸餾水的玻片上，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.4 產孢子實驗

接種平板待其菌絲長滿整個平板后，繼續(xù)培養(yǎng)1周后測定其產孢子數(shù)量。每個平板用15 mL孢子沖洗液(含有6.67 mM 葡萄糖和10 mM 磷酸二氫鉀)沖洗孢子，雙層紗布過濾菌絲后用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

所有數(shù)據(jù)均采用使用Excell和SPSS18進行分析和圖表制作。

2 實驗結果與分析

2.1 吡蟲啉對鏈格孢菌生長的影響

為了探索吡蟲啉對鏈格孢菌生長的影響，首先用添加不同濃度吡蟲啉的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)鏈格孢菌，以添加吡蟲啉溶劑甲醇為對照，培養(yǎng)4 d后測量各處理下菌落生長直徑。結果如圖1所示，5 mg·L-1的吡蟲啉對鏈格孢菌生長沒有明顯作用，但20 mg·L-1和100 mg·L-1的吡蟲啉顯著顯著性地抑制了鏈格孢菌的生長，且抑制作用隨濃度增加而變強。因此，后續(xù)采用了20 mg·L-1的濃度進行驗證。如圖2所示，與空白對照相比，添加等量甲醇對鏈格孢菌的生長無明顯作用，說明吡蟲啉溶劑甲醇對鏈格孢菌的生長無明顯影響。但是在培養(yǎng)的第4、6、8天，添加吡蟲啉的培養(yǎng)基上菌落直徑均顯著性小于添加甲醇的培養(yǎng)基上的菌落，說明吡蟲啉在20 mg·L-1時即可顯著性地抑制鏈格孢菌的生長，因此后續(xù)實驗也都采取了該濃度。

圖1 不同濃度吡蟲啉對鏈格孢菌生長的影響

圖2 吡蟲啉對鏈格孢菌生長的影響

圖中所示數(shù)值為培養(yǎng)4 d時10個平板的菌落直徑平均值 ± 標準差，不同字母表示有顯著性差異(ANOVA，P<0.05)。

A. 鏈格孢菌在添加20 mg·L-1的吡蟲啉、等量溶劑甲醇和空白對照培養(yǎng)基上培養(yǎng)2、4、6、8 d時菌落的直徑。圖中所示數(shù)值為10個平板的菌落直徑平均值 ± 標準差，該實驗重復了3次，結果相似。星號表示對比甲醇組差異顯著(T-test,P<0.05)。B. 鏈格孢菌在培養(yǎng)8d后菌落照片，上為平板正面，下為平板背面，從左至右分別為：空白對照、甲醇對照和吡蟲啉處理。

2.2 吡蟲啉抑制鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響

為了進一步研究吡蟲啉對鏈格孢菌生長的影響，我們在顯微鏡下觀察了添加20 mg·L-1吡蟲啉和等量溶劑甲醇培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲形態(tài)。如圖3所示，吡蟲啉處理下菌絲明顯更加纖細，且有部分畸形，說明吡蟲啉不僅減緩了鏈格孢菌的生長速度，還影響了其菌絲形態(tài)。

圖3 鏈格孢菌在不同處理下的菌絲形態(tài) (100 x)

A: 空白對照；B: 甲醇對照；C: 吡蟲啉處理。

2.3 吡蟲啉抑制鏈格孢產孢子

為了解吡蟲啉對鏈格孢菌繁殖的影響，本研究檢測了不同處理下鏈格孢菌產生的分生孢子數(shù)量。如表1所示，甲醇組產孢子數(shù)量隨低于空白對照組，但差異不顯著，而吡蟲啉組的孢子數(shù)則顯著性少于甲醇對照組，說明吡蟲啉抑制了鏈格孢菌的產孢子這一繁殖過程。

表1 吡蟲啉對鏈格孢菌產孢子的影響

3 結論

施用各種農藥，包括殺蟲劑和殺菌劑，是目前防治病蟲害最主要和最有效的方法，但是存在很多濫用的問題，導致對環(huán)境的污染和種植成本的增加。據(jù)調查，我國農藥的單位面積使用量處于較高水平, 約為世界平均水平的2.50倍[7]。而在2015年我國農業(yè)部就制定了《到2020年農藥使用量零增長行動方案》，提出了科學用藥的目標[8]。因此，農藥的科學利用和使其功效最大化是亟需解決的問題。吡蟲啉從開發(fā)以來一直是作為一種高效低毒的殺蟲劑被廣泛用于田間殺蟲。筆者研究顯示吡蟲啉可以直接抑制植物病原真菌鏈格孢菌的生長和繁殖，說明吡蟲啉還有可能作為抗菌劑使用。結合其它研究表明吡蟲啉可以增強植物的抗病性，說明吡蟲啉有潛力作為一種綜合防治藥劑，既能抗蟲，又能抗病，一藥多用。后續(xù)可結合田間實際蟲害和病害的發(fā)生規(guī)律，優(yōu)化其使用時間和劑量，達到環(huán)保和節(jié)約種植成本的雙重目標。