楊 林，殷永紅

(1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院 附屬醫(yī)院)，湖北 黃石 435000；2. 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435000)

青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb.) Rehd. et Wils. 和毛青藤Sinomeniumacutum(Thunb.) Rehd. et Wils. var.cinereumRehd. et Wils. 的干燥藤莖。每年秋末和冬初進(jìn)行采割，將其扎成把或切成長(zhǎng)段后，曬干保存。青風(fēng)藤中含有大量的生物堿類(lèi)化學(xué)成分，其中以木蘭花堿和青藤堿的含量較高，且研究較為廣泛，二者為該植物中主要的生物堿成分。青風(fēng)藤在中國(guó)藥典的2015年版一部中有收載，藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以青風(fēng)藤植物的干燥品來(lái)計(jì)算，其中生物堿青藤堿的含量要求不能少于干燥品的0.50%。木蘭花堿(magnoflorine，圖1 A)，又名木蘭堿，別名唐松草堿[1]，被證實(shí)具有多種生物學(xué)活性，主要包括抗高血壓、緩解焦慮、防治腫瘤、對(duì)抗炎癥、抑制生育以及緩解運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的疲勞等藥理作用[2～4]；青藤堿(sinomenine，圖1 B)具有抗炎免疫、對(duì)抗風(fēng)濕、防治腫瘤和鎮(zhèn)痛等生物活性[5, 6]。二者作為青風(fēng)藤的主要成分，其含量測(cè)定對(duì)于青風(fēng)藤的質(zhì)量控制具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 木蘭花堿(A)和青藤堿(B)的結(jié)構(gòu)式

目前能檢索到多篇研究文獻(xiàn)，報(bào)道了采用高效液相色譜法(HPLC-UV)測(cè)定中藥青風(fēng)藤及含有青風(fēng)藤中藥復(fù)方中木蘭花堿和青藤堿的含量[7, 8, 9]。筆者擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)建立并驗(yàn)證野生青風(fēng)藤中木蘭花堿和青藤堿含量的測(cè)定方法，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國(guó)Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS /MS，美國(guó)Finnigan公司)；賽多利斯Sartorius BS110S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；AS3120A(鋁)型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Thermo Micro17R微量臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；WH-2 微型漩渦混合器(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥

野生青風(fēng)藤采自湖北省宜昌市興山縣。木蘭花堿對(duì)照品(含量98.0%)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，青藤堿對(duì)照品(含量94.6%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。色譜純甲醇、乙腈購(gòu)自美國(guó)TEDIA(天地)試劑公司；水為娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為Kromasil Eternity-5 C18 色譜柱(2.1 mm × 50 mm，5 μm)；流動(dòng)相采用水(A)-乙腈(B)進(jìn)行梯度洗脫(表1)，流速設(shè)置為0.6 mL·min-1；柱溫設(shè)置為30℃，進(jìn)樣體積為10 μL。

表1 梯度洗脫

質(zhì)譜條件：電離源采用電噴霧離子化(ESI)電離源；掃描方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，在正離子模式下進(jìn)行監(jiān)測(cè)。噴霧電壓3500 V；加熱毛細(xì)管溫度(TEM)為270℃；鞘氣流速30 psi；輔助氣流速15 psi；碰撞氣(CID)壓力為1.5 mTorr；源內(nèi)碰撞解離電壓(Source CID)為10 V；被測(cè)物木蘭花堿和青藤堿的檢測(cè)離子對(duì)分別選擇m/z 342.4→297.3和330.2→152.2(圖2)，碰撞電壓分別設(shè)置為24 eV和32 eV。

圖2 木蘭花堿(A)和青藤堿(B)的質(zhì)譜

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取適量的木蘭花堿對(duì)照品和青藤堿對(duì)照品，分別稱(chēng)取適量各對(duì)照品，精密稱(chēng)定，并分別置于100 mL容量瓶中，加入適量色譜甲醇溶液使兩種對(duì)照品分別溶解完全，然后定容至刻度，配制成木蘭花堿和青藤堿濃度分別為412 μg·mL-1和590 μg·mL-1的兩對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，并放置于4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行保存。正式實(shí)驗(yàn)前，將兩對(duì)照品儲(chǔ)備溶液進(jìn)行等體積混合。

1.3.3 供試品溶液的制備 將青風(fēng)藤藥材粉末過(guò)三號(hào)篩，取出約0.1 g該藥材粉末，精密稱(chēng)定，放置于具塞的錐形瓶中，精密量取并加入20 mL70%的乙醇溶液，密塞，并精密稱(chēng)定其重量，超聲功率設(shè)置為250 W、頻率設(shè)置為20 kHz，進(jìn)行20 min的超聲處理后，將錐形瓶在室溫中放冷，再次稱(chēng)定其重量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足超聲處理過(guò)程中減失的重量，振搖使之混合均勻，取出1 mL提取液的續(xù)濾液，放置于100 mL容量瓶中，加入純甲醇溶液，振搖均勻，并定容至刻度。再次搖勻后，取出稀釋后提取液適量，以14 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min后，吸取上清液置于進(jìn)樣小瓶中，每份樣品定量吸取2 μL樣品溶液注入LC-MS/MS系統(tǒng)，進(jìn)行濃度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 專(zhuān)屬性

分別取空白溶液(甲醇)、木蘭花堿和青藤堿混合對(duì)照品溶液和供試品溶液采用“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件，進(jìn)樣2 μL分析，獲得木蘭花堿和青藤堿特征色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)方法的專(zhuān)屬性良好，被測(cè)物木蘭花堿和青藤堿不受雜質(zhì)物質(zhì)干擾，保留時(shí)間、分離度及峰形滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，見(jiàn)圖3。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別精密量取木蘭花堿和青藤堿混合對(duì)照品溶液0.01 mL，0.03 mL，0.05 mL，0.10 mL，0.15 mL和0.20 mL置100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成木蘭花堿質(zhì)量濃度為20.6 ng·mL-1，61.8 ng·mL-1，103 ng·mL-1，206 ng·mL-1，309 ng·mL-1和412 ng·mL-1和青藤堿質(zhì)量濃度為29.5 ng·mL-1，88.5 ng·mL-1，147.5 ng·mL-1，295 ng·mL-1，442.5 ng·mL-1和590 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣2 μl進(jìn)行分析，以被測(cè)化合物木蘭花堿和青藤堿的選擇離子色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的各個(gè)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到木蘭花堿的線性回歸方程為Y = 4.509 X + 0.139，相關(guān)系數(shù)為r2= 0.9996；青藤堿的線性回歸方程為Y = 3.915 X + 0.107，相關(guān)系數(shù)為r2= 0.9998。結(jié)果表明，木蘭花堿和青藤堿分別在20.6～412 ng·mL-1和29.5～590 ng·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[10]。

2.3 精密度

取被測(cè)物混合對(duì)照品(木蘭花堿濃度為206 ng·mL-1，青藤堿濃度為295 ng·mL-1)溶液按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣2 μl，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算得木蘭花堿和青藤堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n = 6)分別為1.95%和1.84%，該結(jié)果表明方法精密度良好。

A：木蘭花堿；B：青藤堿；I：甲醇；II：對(duì)照品溶液；III：供試品溶液

2.4 重復(fù)性

取同一青風(fēng)藤藥材供試品6份，每份約0.1 g，精密稱(chēng)定，按“1.3.3 供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法進(jìn)行處理，按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得青風(fēng)藤中木蘭花堿和青藤堿的含量平均值分別為1.96 mg·g-1和5.50 mg·g-1，RSD分別為1.93%和2.00%(n = 6)，該結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性

取同一份青風(fēng)藤藥材供試品溶液，分別于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h和24 h按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。木蘭花堿和青藤堿峰面積的RSD分別為1.82%和1.65%(n = 7)，該結(jié)果表明青風(fēng)藤供試品溶液中木蘭花堿和青藤堿在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的青風(fēng)藤藥材供試品6份，每份約0.05 g，精密稱(chēng)定，按“1.3.3 供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法進(jìn)行處理，并添加適當(dāng)濃度的混合對(duì)照品溶液后，使木蘭花堿和青藤堿的理論含量接近測(cè)定供試品中木蘭花堿和青藤堿含量的80%，100%和120%，每種理論含量各平行配制3份，過(guò)濾后，按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，回收率結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n = 3)

2.7 樣品含量測(cè)定

取青風(fēng)藤供試品適量，研細(xì)成粉末，過(guò)三號(hào)篩，取藥材粉末約0.1 g，精密稱(chēng)定，按“1.3.3 供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法處理，按“1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得野生青風(fēng)藤供試品中木蘭花堿和青藤堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果 (mg·g-1)

3 討論

青風(fēng)藤作為傳統(tǒng)中藥，具有較高的臨床藥用價(jià)值，長(zhǎng)期以來(lái)廣泛應(yīng)用于臨床，其味苦性平，歸肝、脾經(jīng)，該味藥具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利小便等功效。青風(fēng)藤主要含有揮發(fā)油、生物堿、脂、甾醇等多類(lèi)化學(xué)成分，其中生物堿類(lèi)成分為祛風(fēng)止痛的主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制與免疫調(diào)節(jié)等作用[11]。因此青風(fēng)藤中主要生物堿的含量測(cè)定，對(duì)于藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。

采用LC-MS/MS法建立了野生青風(fēng)藤中木蘭花堿和青藤堿含量的同時(shí)測(cè)定方法，LC-MS/MS法較前人報(bào)道的HPLC-UV法極大的縮短了分析時(shí)間，靈敏度顯著提高，并提高了分析方法的特異性和專(zhuān)屬性。該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可以應(yīng)用到野生植物中木蘭花堿和青藤堿的含量測(cè)定研究中，并為藥用植物的質(zhì)量控制提供一定的理論依據(jù)。