張凱輝，段行武，陳曦，張潤田

1北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 101100；2北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院

尋常型銀屑病（PV）為臨床常見慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，發(fā)病原因尚未完全明確，臨床干預(yù)仍以對癥治療為主［1-2］。因此，本病病因?qū)W的研究不但可進(jìn)一步明確病因，對臨床治療更具有重要指導(dǎo)意義。臨床普遍認(rèn)為，PV為多基因遺傳背景下的免疫性疾病，T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂為PV發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）為近年來發(fā)現(xiàn)的具有顯著免疫抑制作用的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，對預(yù)防自身免疫性疾病具有重要作用［4］。有研究表明［5］，PV患者輔助性T淋巴細(xì)胞17（Th17）數(shù)量及其分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17（IL-17）較健康人群升高。薛瀟春等［6］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠外周血輔助性T淋巴細(xì)胞中程序性死亡因子1（PD-1）及配體（PDL1）水平降低，可能引起小鼠免疫細(xì)胞失衡，導(dǎo)致或加重PV。本研究探討了PV患者外周血Th17/Treg及負(fù)性共刺激因子水平變化，旨在為尋找新的免疫治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選取2018年1月—2020年8月我院收治的PV患者35例（觀察組）及體檢健康者35例（對照組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組符合《中國銀屑病診療指南（2018完整版）》中PV診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；對照組無免疫性、系統(tǒng)性疾病，無銀屑病家族史；②臨床資料完整；③受試者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近2個月內(nèi)曾服用免疫抑制劑、維A酸類、皮質(zhì)類固醇激素藥物；②孕婦及哺乳期；③伴有紅斑狼瘡等自身免疫性疾病；④入組前1個月內(nèi)曾接受外用藥物治療、紫外線及光化學(xué)療法等物理治療；⑤合并扁桃體炎、上呼吸道感染、炎性腸病等其他疾??；⑥合并其他皮膚病。觀察組男19例、女16例，年齡（39.65±11.84）歲；BMI為過輕6例、正常23例、超重4例、肥胖2例；飲酒22例、不飲酒13例，吸煙16例、不吸煙19例；已婚20例、未婚15例；PV面積與嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分［8］（24.68±7.19）分，≤24分（輕度）19例、＞24分（中重度）16例。對照組男17例、女18例，年齡（41.69±10.65）歲，BMI為過輕8例、正常20例、超重5例、肥胖2例；飲酒18例、不飲酒17例，吸煙10例、不吸煙25例；已婚24例、未婚11例。除PASI外，兩組年齡、性別、BMI等基本資料具有可比性。

1.2 標(biāo)本采集與處理 于清晨采集觀察組治療前和對照組空腹靜脈血5 mL，分為兩等份。一份置于肝素鈉抗凝管內(nèi)，用于流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞；另一份以2 000 r/min離心20 min，取上層血清，采用密度梯度離心法提取外周血單個核細(xì)胞（PBMC），用于PCR檢測負(fù)性共刺激因子PD-1、PDL1 mRNA。

1.3 Treg檢測方法 取試管2支，均加入肝素鈉抗凝血100μL，加入CD25-PE、CD4-FITC各20μL混勻，4℃下避光反應(yīng)30 min；加入緩沖液2 mL混勻，室溫下以2 000 r/min離心5 min，去除上清液，將殘留液同細(xì)胞混勻；2支試管分別加入新鮮配制的固定/透化液1 mL混勻，4℃下避光反應(yīng)45 min；再加入1×透化液2 mL混勻，室溫下以2 000 r/min離心5 min；重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，末次離心后去除上清液，重懸細(xì)胞；2支試管分別加入大鼠血清2μL混勻，4℃下避光孵育15 min，一管加入20μL FoxP3-PECy5，另一管作為對照加入5μL IgG2a-PE-Cy5混勻，4℃下避光反應(yīng)30 min；加透化液2 mL混勻，以2 000 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2遍，第2次離心后去除上清液；加入適量緩沖液混勻，于24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測；以CD25、CD4設(shè)門區(qū)分CD25+、CD4+細(xì)胞，再測定FOXP3+細(xì)胞，并以散點(diǎn)圖表示，以熒光抗體染色陽性細(xì)胞百分比記錄結(jié)果。

1.4 Th17檢測方法 將PBMC懸液接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 mL；每孔加入2μL刺激劑，37℃5%CO2下于培養(yǎng)箱孵育5 h；將細(xì)胞懸液置于2支試管內(nèi)，以2 000 r/min離心10 min，去除上清液，重懸細(xì)胞；分別于2支試管內(nèi)加入500μL破膜劑混勻，4℃下孵育10～15 min；室溫下以2 000 r/min離心5 min，去除上清液，重懸細(xì)胞；一管加入5μL PerCPCD8a抗體、20μL FITC-CD3、20μL PE-IL-17A，另一管作為對照加入5μL PerCP-CD8a抗體、20μL FITC-CD3、5μL PE-IgG1混勻，4℃下避光孵育30 min；2支試管分別加入PBS緩沖液2 mL，室溫下以2 000 r/min離心5 min，去除上清液，重懸細(xì)胞；2支試管分別加入PBS緩沖液300～500μL，重懸細(xì)胞，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測；以CD3、CD8直方圖設(shè)門區(qū)分出CD3+、CD8+細(xì)胞，以散點(diǎn)圖表示IL-17+細(xì)胞，即CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞群來代表Thl7細(xì)胞，以熒光抗體染色陽性細(xì)胞百分比記錄結(jié)果。

1.5 PD-1、PD-L1 mRNA檢測方法 采用RT-PCR檢測PBMC中PD-1、PD-L1 mRNA。TRIzol法提取PBMC中總RNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；對提取RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系10μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃延伸30 s，共40個循環(huán)；每升高1℃采集熒光信號5次，將β肌動蛋白作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Logistic回歸分析各指標(biāo)與PV發(fā)生的關(guān)系，采用偏相關(guān)性、Pearson相關(guān)系數(shù)分析指標(biāo)相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平比較 觀察組外周血Th17、PD-L1 mRNA水平高于對照組，PD-1 mRNA水平低于對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平比較（±s）

表1 兩組外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組對照組n 35 35 Th17（%）3.53±0.55*3.30±0.21 Treg（%）4.29±1.04 3.89±1.12 PD-1 mRNA 0.20±0.11*0.35±0.14 PD-L1 mRNA 2.78±0.91*2.09±0.78

2.2 外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平與PV發(fā)生的關(guān)系 Logistic回歸分析顯示，Th17、PDL1 mRNA高于均值者發(fā)生PV的風(fēng)險增加，而PD-1 mRNA高于均值者發(fā)生PV的風(fēng)險降低（P均＜0.05）。見表2。

2.3 不同病情PV患者外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平比較 PV輕度患者外周血Th17、PDL1 mRNA水平低于中重度者，PD-1 mRNA水平高于中重度者（P均＜0.05）。見表3。

表2 外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平與PV發(fā)生的關(guān)系

表3 不同病情PV患者外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平比較（±s）

表3 不同病情PV患者外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平比較（±s）

注：與輕度患者比較，*P＜0.05。

PV病情輕度中重度n 19 16 Th17（%）3.31±0.22 3.79±0.20*Treg（%）4.35±0.91 4.22±0.98 PD-1 mRNA 0.26±0.08 0.13±0.05*PD-L1 mRNA 2.51±0.52 3.10±0.67*

2.4 PV患者外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子水平與PASI評分的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PV患者外周血Th17水平與PASI評分呈正相關(guān)（r=0.740，P＜0.01），Treg與PASI評分無相關(guān)性（r=-0.264，P=0.126），PD-1 mRNA與PASI評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.636，P＜0.01），PD-L1 mRNA與PASI評分呈正相關(guān)（r=0.726，P＜0.01）。將年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒史、吸煙史、合并疾病、疾病類型、Treg等控制后，偏相關(guān)性分析顯示PV患者外周血Th17、PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA仍與PASI評分有關(guān)（標(biāo)準(zhǔn)化β分別為8.552、-6.890、8.769，P均＜0.01）。

2.5 PV患者外周血Th17/Treg、負(fù)性共刺激因子間的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PV患者外周血Th17與PD-1 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.845，P＜0.01）、與PD-L1 mRNA呈 正 相 關(guān)（r=0.653，P＜0.001），Treg與PD-1、PD-L1 mRNA均無相關(guān)性（r分別為0.140、-0.063，P均＞0.05）。

3 討論

PV又稱“牛皮癬”，發(fā)病周期較長，且難以根除，易復(fù)發(fā)，發(fā)病人群以中青年為主，對患者身心健康造成巨大損害［9-10］。目前，國內(nèi)外對此病發(fā)病原因及機(jī)制的研究雖取得一定成就，但仍未得到確切結(jié)論。因此，探討PV病因與發(fā)病機(jī)制已成為皮膚科領(lǐng)域重要研究課題之一。

大量研究證實(shí)［11-12］，PV病理特點(diǎn)為自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的持續(xù)激活；多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，PV發(fā)病核心為細(xì)胞免疫紊亂，尤其同CD4+T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)。吳明順等［13］發(fā)現(xiàn)，活化的CD4+T淋巴細(xì)胞根據(jù)抗原性質(zhì)、細(xì)胞因子類型不同分為輔助性T淋巴細(xì)胞1（Th1）、輔助性T淋巴細(xì)胞2（Th2）、Th17、Treg四個細(xì)胞亞群。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)單純以Th1/Th2細(xì)胞失衡理論，無法完全解釋PV免疫發(fā)病機(jī)制。Th17與Treg的功能和分化過程相互對抗，正常情況下二者保持平衡，以維持機(jī)體免疫穩(wěn)定［14-15］。Th17/Treg失衡的發(fā)現(xiàn)可彌補(bǔ)Th1/Th2介導(dǎo)效應(yīng)機(jī)制不足，有助于臨床深入研究CD4+T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，為臨床深入研究PV發(fā)病機(jī)制及治療開辟新思路。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較，PV患者外周血Th17水平升高，Treg水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HOHENBERGER等［16］研究亦證實(shí)，PV皮損中IL-17水平高于正常皮膚。分析其原因在于：①Th17細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-17、IL-26、IL-21、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等發(fā)揮生物學(xué)作用，具有強(qiáng)大的致炎性。已有研究證實(shí)，Th17在紅斑狼瘡、硬皮病等自身免疫性疾病中均有不同程度增加。這提示Th17可能參與PV皮損內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤過程，與PV皮損內(nèi)角化不全區(qū)可見毛細(xì)血管擴(kuò)張、Munro微膿腫，周圍可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤的病理特點(diǎn)相符合。②Treg細(xì)胞占正常人外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞的5%～10%，在外周血中數(shù)量較少。本研究發(fā)現(xiàn)，健康人群與PV患者Treg水平無顯著差異，可能與研究對象所處病程及取材部位不同有關(guān)。由此可見，Treg細(xì)胞及相關(guān)因子在銀屑病患者體內(nèi)的行為還需進(jìn)一步探究。

近年來，關(guān)于負(fù)性共刺激因子的表達(dá)成為研究熱點(diǎn)。PD-1分子屬CD28/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原超家族，主要通過與其配體PD-L1結(jié)合傳遞負(fù)性協(xié)同刺激信號，抑制T淋巴細(xì)胞增殖活化，進(jìn)而在外周免疫耐受建立中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，與健康人群比較，PV患者外周血PD-L1 mRNA水平下降而PD-1 mRNA水平升高，可能與PV患者PBMC中程序性細(xì)胞死亡受體1（PDCD1）基因的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。PD-1 mRNA表達(dá)升高可能是機(jī)體對PDCD1表達(dá)量下調(diào)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，PDCD1的負(fù)性調(diào)控信號減弱，PD-L1 mRNA表達(dá)下降，下游信號通路的NF-κB等分子過度激活，致使單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞過度活化，產(chǎn)生大量炎癥因子。本研究結(jié)果顯示，外周血Th17、PD-1 mRNA高于均值者發(fā)生PV風(fēng)險增加，PD-L1 mRNA高于均值者發(fā)生PV風(fēng)險降低，說明Th17、PD-L1 mRNA、PD-1 mRNA變化與PV發(fā)病關(guān)系密切。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著PV病情進(jìn)展，患者外周血Th17、PD-L1 mRNA水平升高，PD-1 mRNA水平降低。廖曉容等［17］發(fā)現(xiàn)，PV進(jìn)行期患者外周血Th17細(xì)胞比例及血清IL-17水平高于靜止期患者，與本研究結(jié)果相一致。此外，相關(guān)性分析顯示，PV患者外周血Th17、PD-L1 mRNA水平與PASI評分呈正相關(guān)，PD-1 mRNA與PASI評分呈負(fù)相關(guān)。這說明PV患者外周血Th17、PD-L1 mRNA、PD-1 mRNA與PV病情程度有關(guān)，有望成為評估PV嚴(yán)重程度的可靠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。華圣元等［18］通過免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)，PV患者皮損真皮上部廣泛表達(dá)PD-1，皮損處70%的T淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1，超過95%的IL-17A+T淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1。但是，Th17與負(fù)性共刺激因子間是否具有相關(guān)性仍不十分明確。本研究發(fā)現(xiàn)，PV患者外周血Th17與PD-1 mRNA呈負(fù)相關(guān)、與PD-L1 mRNA呈正相關(guān)。其原因可能為PV患者PDCD1基因缺失后失去抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17等炎性因子的能力，致使IL-17水平升高，極大增加了對中性粒細(xì)胞的招募及炎癥通路的過度激活；Th17表達(dá)所致PD-1下調(diào)，致使PD-1與PD-L1結(jié)合變少，進(jìn)一步上調(diào)PDL1 mRNA表達(dá)。這提示臨床可從糾正PD-L1、PD-1 mRNA表達(dá)及減少Th17方面出發(fā)，選擇恰當(dāng)藥物治療PV。

綜上可知，PV患者外周血Th17、PD-L1 mRNA水平升高而PD-1 mRNA水平降低，且三者與PV發(fā)生及患者病情程度具有相關(guān)性；糾正PV患者Th17/Treg及負(fù)性共刺激因子表達(dá)有望成為新的藥物治療靶點(diǎn)，可為PV治療提供新的方向。