戴意強(qiáng)，劉小莉，吳 寒，尹麗卿，周劍忠，董明盛，夏秀東,

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210095）

大豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高，含豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，此外，鈣、鐵、磷等微量元素豐富[1]。大豆可以被加工成各種豆制品，其中最受消費(fèi)者歡迎的豆制品是豆腐。在豆腐制作過程中，點(diǎn)漿會(huì)影響最終產(chǎn)品的品質(zhì)，是大豆蛋白形成凝膠過程中最關(guān)鍵的步驟。在該過程中，涉及的分子間作用力主要有共價(jià)鍵（二硫鍵）以及疏水作用和靜電作用等非共價(jià)作用。生豆?jié){中蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)位于分子外部，而疏水基團(tuán)位于分子內(nèi)部，此時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在煮漿過程中，由于溫度的升高，蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加劇，疏水基團(tuán)暴露，氫鍵被破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生變性[1]。凝固劑的加入可以進(jìn)一步促使蛋白質(zhì)分子間作用力改變，形成不溶性蛋白聚集體。

目前，被廣泛應(yīng)用的豆腐凝固劑有MgCl2、CaSO4等鹽類凝固劑和葡萄酸-δ-內(nèi)酯（glucono-δ-lactone，GDL）、醋酸等酸類凝固劑[2]。鹽橋理論是解釋鹽誘導(dǎo)大豆蛋白凝固機(jī)理的主要理論[3]。鹽類凝固劑在大豆蛋白溶液中解離并釋放Mg2+、Ca2+等陽離子，通過屏蔽蛋白質(zhì)的表面負(fù)電荷以減少蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，并與蛋白分子結(jié)合，充當(dāng)“橋梁”的作用[4?5]。酸類凝固劑誘導(dǎo)大豆蛋白凝固的機(jī)理主要是酸類凝固劑可以降低蛋白溶液的pH，當(dāng)pH 接近大豆蛋白等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷減少，疏水作用和二硫鍵含量增加，蛋白分子間靜電斥力下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集形成凝膠[6?7]。盡管目前對(duì)蛋白質(zhì)凝膠過程中涉及的分子間作用力有所報(bào)道，但對(duì)不同凝固劑誘導(dǎo)蛋白聚集的分子間作用力的比較及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化鮮有研究。本文以大豆分離蛋白（Soy protein isolate，SPI）作為研究對(duì)象，研究了不同凝固劑（MgCl2、CaSO4、乳酸、醋酸、GDL 和酸漿）對(duì)誘導(dǎo)大豆蛋白凝固過程中分子間作用力和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮黃漿水 由南京豆制品生產(chǎn)企業(yè)提供；植物乳桿菌D1031 來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程實(shí)驗(yàn)室；酸漿（pH4.0） 由黃漿水經(jīng)植物乳桿菌D1031 在37 ℃條件下發(fā)酵24 h得到；MgCl2、CaSO4、乳酸和醋酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GDL 上海瑞永生物科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）和5,5'-二硫代雙（DTNB） 上海麥克林生化科技有限公司。

FiveEasy PluspH 計(jì) 梅特勒-托利多有限公司；FDU-1200 冷凍干燥機(jī) 日本EYELA 公司；T25 分散機(jī) 德國(guó)IKA 公司；Cytation5 多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；ZSP 納米粒度電位儀 馬爾文儀器公司；J-1500 圓二色譜儀（CD） 日本JASCO 公司；3K15 離心機(jī) 美國(guó)Sigma 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SPI 的提取 SPI 的制備參照Chen 等[8]報(bào)道的方法。脫脂豆粉按照1:15 的料液比加入去離子水溶解，并用2 mol/L NaOH 調(diào)至pH 為7.5，25 ℃下攪拌2 h 后，在4 ℃，8000 g 下離心20 min。上清液用2 mol/L 鹽酸調(diào)至pH 為4.5 后，在4 ℃，8000 g 下離心10 min，此時(shí)獲得的沉淀用其5 倍質(zhì)量的去離子水清洗2 次，并于8000 g 離心10 min。沉淀按1:5的料液比加入去離子水后，用2 mol/L NaOH 調(diào)至pH 為7.0，經(jīng)冷凍干燥獲得SPI 粉末。利用凱氏定氮法測(cè)定凍干SPI 粉末中蛋白質(zhì)含量為93.62%。

1.2.2 SPI 豆腐的制作 800 mL 5%（w/v）的SPI 溶液煮沸5 min，并于85 ℃保溫，緩慢加入凝固劑（3‰MgCl2、3‰ CaSO4、3‰ GDL，20% pH 2.0 乳酸，30%pH 3.0 醋酸或35% pH 4.0 酸漿），制成6 種凝固劑處理的SPI 凝膠。在加入凝固劑0、3、10、20、30、和45 min 后，將SPI 溶液或凝膠迅速放置于冰浴中至其溫度降至室溫（處理0 min 是指SPI 溶液加入凝固劑后立刻進(jìn)行冰?。?。另取二分之一的樣品凍干，用于游離巰基（SH）和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。

1.2.3 pH 的測(cè)定 利用pH 計(jì)測(cè)定加入凝固劑后SPI 溶液的pH 變化。

1.2.4 表面疏水性的測(cè)定 SPI 溶液表面疏水性的測(cè)定參照Shigeru 等[9]所述方法并做適當(dāng)修改。SPI 凝膠5000 r/min 勻漿3 min 后，用0.01mol/L pH 7.0 磷酸緩沖溶液（PBS）進(jìn)行梯度稀釋，得到0%～0.05%蛋白濃度的系列溶液，取20 μL 8.0 mmol/L ANS 溶液添加到2 mL 稀釋樣品中。避光反應(yīng)20 min后，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為390 和470 nm，狹縫寬度為10 nm。SPI 表面疏水力指數(shù)以熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度曲線的初始斜率表示。

1.2.5 游離巰基的測(cè)定 SPI 溶液游離巰基的測(cè)定參照Zhang 等[10]報(bào)道的方法。稱取40 mg 凍干樣品并溶解于4 mL Tris-Gly 緩沖溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Gly 和4 mmol/L Na2EDTA，pH 8.0）中，并于25 ℃下放置30 min。10000 g 離心20 min后，上清液中加入30 μL Ellman 試劑溶液（4 mg DTNB 溶于1 mL Tris-Gly 緩沖溶液），25 ℃反應(yīng)15 min 后，在412 nm 處測(cè)定吸光值。上清液中蛋白質(zhì)含量使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。游離巰基含量用以下公式計(jì)算：

游離巰基含量=（A412/ε）×D/c

式中：A412表示在波長(zhǎng)412 nm 下的吸光值，ε 表示吸光系數(shù)（13600 mol?1cm?1L），D 表示稀釋倍數(shù)，c 表示離心后上清液蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.6 Zeta 電位的測(cè)定 Zeta 電位的測(cè)定參照Liang等[11]所述方法。SPI 凝膠于5000 r/min 勻漿3 min后，用去離子水稀釋200 倍，使用電位儀測(cè)定SPI 凝膠的Zeta 電位。溶劑為去離子水，折光系數(shù)為1.33，介電常數(shù)為78.54。

1.2.7 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 稱取0.1 g SPI 凍干樣品，溶于5 mL 去離子水中，利用CD 測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用儀器自帶軟件模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）的比例。測(cè)定條件：0.1 cm 厚度的石英比色皿；190～250 nm 波長(zhǎng)掃描；掃描3 次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定三次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)差異性分析采用Duncan 比較模型，差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凝固劑對(duì)SPI 溶液pH 的影響

由圖1 可知，乳酸、醋酸和酸漿能降低SPI 溶液的pH，并在3 min 內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，而加入GDL 的SPI 溶液pH 在10 min 之內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，為5.40～5.48，這與Cao 等[12]的研究一致，即加入0.30 g/100 mL GDL 的豆乳凝膠的最終pH 為5.42。鹽類凝固劑的加入也會(huì)降低SPI 溶液的pH，這可能與凝固劑中Ca2+和Mg2+與植酸作用有關(guān)[13]。值得注意的是，加入酸類凝固劑的SPI 溶液的pH 顯著低于加入鹽類凝固劑的SPI 溶液。Hsia 等[14]研究表明大豆蛋白7Sα′、7Sα、7Sβ、11S A1a、11S A1b、11S B1a、11S B1b、11S A2、11S A3 和11S A4 的等電點(diǎn)分別為5.23，5.07，5.88，5.78，5.28，5.46，5.73，5.46，5.60 和5.29。MgCl2和CaSO4的加入雖然能使SPI 溶液pH 降低，但與大豆蛋白的等電點(diǎn)相差較大，因此鹽類凝固劑導(dǎo)致的SPI 溶液pH 的降低不是大豆蛋白聚集的主要原因。pH 的降低減弱了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，有利于蛋白質(zhì)聚集，而Ca2+和Mg2+以“鹽橋”的方式與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，形成大豆蛋白凝膠[15]。

圖1 不同凝固劑誘導(dǎo)SPI 溶液pH 的變化Fig.1 Changes of pH value of SPI solution induced by different coagulants

2.2 不同凝固劑對(duì)SPI 溶液表面疏水作用力的影響

蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的隨機(jī)聚集和凝膠形成，亞基的解離和多肽鏈的展開都能引起疏水作用力的升高，因此表面疏水作用力的變化在一定程度上能夠反映蛋白質(zhì)聚集過程中的結(jié)構(gòu)變化[16]。由圖2 可知，與僅熱處理的SPI（312.94）相比，加入凝固劑的SPI 溶液表面疏水作用力顯著增加（P<0.05）。MgCl2和CaSO4引起SPI 溶液中離子強(qiáng)度增加，并改變蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，隱藏在SPI 內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露出來，導(dǎo)致蛋白疏水性增加[17]。乳酸、醋酸、GDL 和酸漿會(huì)降低SPI 溶液的pH，當(dāng)溶液pH 接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白的表面電荷和溶解度均降低，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而引起蛋白表面疏水作用力升高，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。隨著凝固劑加入時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI 溶液表面疏水性逐漸降低，這可能是因?yàn)楸┞冻鰜淼氖杷鶊F(tuán)由于疏水性聚集，導(dǎo)致疏水基團(tuán)再次被包埋在蛋白聚集體內(nèi)部[18]，此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的疏水區(qū)域靠近帶電荷的側(cè)鏈殘基，靜電相互作用會(huì)影響探針與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)疏水作用力[19]。特別的，GDL 誘導(dǎo)的SPI 凝膠表面疏水性在45 min 內(nèi)持續(xù)下降，這可能與GDL 緩慢釋放H+導(dǎo)致蛋白質(zhì)緩慢聚集有關(guān)。

圖2 不同凝固劑誘導(dǎo)SPI 溶液表面疏水作用力的變化Fig.2 Changes of surface hydrophobicity of SPI solution induced by different coagulants

2.3 不同凝固劑對(duì)SPI 溶液中游離SH 含量的影響

物理和化學(xué)處理可使蛋白質(zhì)構(gòu)象改變并影響SPI 溶液中SH 基團(tuán)含量，因此，游離SH 含量可作為添加凝固劑后SPI 變性程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。與僅熱處理的SPI（4.28 μmol/g 蛋白質(zhì)）相比，凝固劑處理的SPI 溶液中游離SH 含量顯著增加（P<0.05），這可能是因?yàn)閬碜喳}類凝固劑的Ca2+、Mg2+和酸類凝固劑產(chǎn)生的H+與蛋白質(zhì)分子上帶負(fù)電荷的基團(tuán)結(jié)合[16,21]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽鏈的展開，隱藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基暴露。大豆11S 蛋白酸性多肽鏈和堿性多肽鏈通過二硫鍵連接，凝固劑的加入可能會(huì)導(dǎo)致二硫鍵的斷裂，從而引起SPI 溶液中游離SH 含量的增加。由圖3 可知，在加入凝固劑0～45 min 內(nèi)，SPI 溶液中游離SH 含量持續(xù)減少（圖3），這是由于在高溫條件下，暴露的游離巰基氧化反應(yīng)形成二硫鍵[22]。

圖3 不同凝固劑誘導(dǎo)SPI 溶液中游離巰基含量的變化Fig.3 Changes of free sulfhydryl of SPI solution induced by different coagulants

2.4 不同凝固劑對(duì)SPI 溶液Zeta 電位的影響

Zeta 電位通常被用來測(cè)定蛋白表面電荷性質(zhì)，并可以作為評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定性的指標(biāo)[23]。Zeta 電位絕對(duì)值越高，表明體系中靜電斥力越強(qiáng)，膠體系統(tǒng)越穩(wěn)定[24]。加熱處理后的SPI 溶液Zeta 電位絕對(duì)值從30.37 mV 降低至22.43 mV，表明加熱后的SPI 溶液中蛋白質(zhì)粒子穩(wěn)定性下降。當(dāng)加入凝固劑后，SPI 溶液的Zeta 電位進(jìn)一步降低。當(dāng)膠體體系中Zeta 電位絕對(duì)值低于10 mV，膠體體系中的粒子趨向于聚集[23]。如表1 所示，與僅加熱處理的SPI 溶液相比，向SPI 溶液中加入凝固劑會(huì)釋放金屬離子（如Ca2+或Mg2+）或H+，中和變性蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力降低，Zeta 電位的絕對(duì)值下降[25]。

由表1 可知，加入凝固劑的SPI 溶液的Zeta 電位在短時(shí)間達(dá)到穩(wěn)定，這表明凝固劑能快速破壞蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，且該過程對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的破壞是不可逆的。此外，加入MgCl2、乳酸和醋酸的SPI 溶液的Zeta 電位在極短時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，這可能與MgCl2、乳酸和醋酸誘導(dǎo)蛋白凝固速率快有關(guān)。GDL 誘導(dǎo)的SPI 凝膠的Zeta 電位在10～20 min內(nèi)由負(fù)變正，這是因?yàn)镚DL 可在SPI 溶液中緩慢釋放H+，使得最終SPI 溶液呈正電價(jià)[5]。與其他凝固劑處理的SPI 相比，加入酸漿的SPI 溶液的Zeta 電位絕對(duì)值最大，這可能與酸漿中的復(fù)雜組成有關(guān)。Li 等[26]研究表明酸漿中含有大量有機(jī)酸、可溶性蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)、可溶性糖、維生素和礦物質(zhì)等。以上研究結(jié)果表明，不同凝固劑的加入均會(huì)降低蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，使SPI 溶液趨于不穩(wěn)定，促使蛋白質(zhì)的聚集并產(chǎn)生沉淀。

表1 不同凝固劑誘導(dǎo)SPI 溶液Zeta 電位的變化Table 1 Changes of zeta potential of SPI solution induced by different coagulants

2.5 不同凝固劑對(duì)SPI 溶液蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

表2 為不同凝固劑對(duì)SPI 溶液中α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲比例的影響。與僅熱處理的SPI 二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋=26.4%，β-折疊=6.0%，β-轉(zhuǎn)角=5.4%，無規(guī)卷曲=62.2%）相比，加入鹽類凝固劑的SPI 的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的比例降低，而β-折疊的比例增加，這可能是因?yàn)辂}類凝固劑可以通過改變氫鍵位置將α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變成β-折疊[27]。乳酸和醋酸可以完全破壞SPI 中α-螺旋和β-折疊，加入醋酸和GDL 的SPI 的β-轉(zhuǎn)角的比例降低。特別地，加入GDL 的SPI 的α-螺旋比例在0～30 min 內(nèi)從24.9%逐漸降低到0，這可能與GDL 在SPI 溶液中緩慢釋放H+有關(guān)。添加酸漿的SPI 的α-螺旋比例介于加入乳酸和鹽類凝固劑的SPI 溶液之間，而β-轉(zhuǎn)角比例介于加入乳酸和醋酸的SPI 溶液之間，這是因?yàn)樗釢{中主要的有機(jī)酸是乳酸和醋酸[28]，此外還含有一定量的鹽離子，這些物質(zhì)共同作用于蛋白質(zhì)并表現(xiàn)出與單一鹽類凝固劑和酸類凝固劑不同的規(guī)律。

表2 不同凝固劑誘導(dǎo)SPI 溶液蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例的變化（%）Table 2 Changes of secondary structure percent of SPI induced by different coagulants (%)

金屬離子（如Ca2+或Mg2+）和H+可以中和蛋白質(zhì)表面電荷，破壞蛋白質(zhì)分子之間的靜電作用和多肽鏈上-CO 和-NH 之間氫鍵的穩(wěn)定性，導(dǎo)致SPI 的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[29]，并降低SPI 中α-螺旋比例。

2.6 鹽類凝固劑和酸類凝固劑對(duì)SPI 結(jié)構(gòu)變化的影響

7S 蛋白和11S 蛋白是SPI 中主要的蛋白成分，分別呈現(xiàn)三聚體結(jié)構(gòu)和六聚體結(jié)構(gòu)。7S 蛋白和11S 蛋白的變性溫度分別在65～75 ℃和85～95 ℃[15]。本文SPI 溶液煮沸并在85 ℃保溫，7S 蛋白和11S蛋白完全變性，大豆蛋白亞基解離，穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)被打開，轉(zhuǎn)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)[30]（圖4），并在氫鍵、疏水作用力和靜電作用力等分子間作用力下形成可溶性聚集體[31]。高溫會(huì)破壞大豆蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)但對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小[32]。

圖4 不同凝固劑誘導(dǎo)大豆蛋白SPI 膠凝形成的機(jī)理模型Fig.4 Reaction scheme of different coagulants inducing SPI aggregation

鹽類凝固劑（MgCl2、CaSO4）和酸類凝固劑（乳酸、醋酸、GDL 和酸漿）的加入會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)和巰基暴露，蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力降低，但隨著反應(yīng)時(shí)間增加，蛋白質(zhì)分子則會(huì)發(fā)生不同程度的疏水聚集，且游離巰基氧化形成二硫鍵。在這些蛋白質(zhì)分子間作用力的共同作用下，大豆蛋白形成不溶性聚集體。鹽類凝固劑可以以“鹽橋”的方式連接大豆蛋白分子，將蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變成β-折疊。酸類凝固劑降低蛋白溶液的等電點(diǎn)，破壞了蛋白質(zhì)β-轉(zhuǎn)角，并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。

3 結(jié)論

在大豆蛋白凝膠形成過程中，鹽類凝固劑和酸類凝固劑均能降低SPI 溶液的pH，但加入鹽類凝固劑的SPI 溶液的pH 降幅小于酸類凝固劑。與僅熱處理的SPI 溶液相比，加入凝固劑的SPI 溶液表面疏水作用力和游離SH 含量增加，而Zeta 電位降低；但不同凝固劑對(duì)SPI 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響具有一定差異，鹽類凝固劑會(huì)促使SPI 的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，酸類凝固劑則會(huì)破壞SPI 中β-折疊。本文可為研究復(fù)合凝固劑誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠機(jī)理提供一定的基礎(chǔ)，并對(duì)比較不同凝固劑作用下的大豆蛋白聚集和凝膠行為具有參考意義。