徐 佳，涂智鴻，楊建飛，黃雪芹，馬 倩，易 媛，左 勇,,3,

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610000；3.成都裕智果業(yè)有限公司，四川成都 610000）

杏是多年生木本植物的果實(shí)，廣泛種植于我國(guó)的黃河流域各省[1]。杏肉棉軟多汁，口感酸甜，風(fēng)味獨(dú)特，富含氨基酸、維生素、類胡蘿卜素[2]、多酚及類黃酮[3]等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。以杏果為原料釀造的杏酒，不僅具有豐富的香氣，還可以將其大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保留下來(lái)，得到了許多消費(fèi)者的認(rèn)可。但杏果極易氧化褐變，特別是在杏酒陳釀和灌裝階段，均會(huì)發(fā)生明顯的褐變現(xiàn)象，導(dǎo)致杏酒的外觀品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值嚴(yán)重下降。

研究表明，杏果中多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）引起的酶促褐變是導(dǎo)致杏酒褐變的主要原因[4]。所以，控制杏酒的酶促褐變成為抑制其褐變的關(guān)鍵，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)鮮杏及其加工產(chǎn)品抑制褐變的方法集中在熱處理[5]、可食性涂層[6]、高壓二氧化碳技術(shù)[7]、食品護(hù)色劑[8]、工藝條件[9]和品種成熟度[10]等方面。其中物理方法被廣泛應(yīng)用于果蔬的褐變抑制，食品護(hù)色劑常用于果酒中的褐變抑制，但僅添加單一護(hù)色劑易造成使用濃度高、穩(wěn)定性差以及效果不明顯等缺點(diǎn)[11?12]。

本研究擬從6 種安全且常用的食品護(hù)色劑中，以褐變抑制率和色差值為指標(biāo)，將前三種護(hù)色劑進(jìn)行復(fù)配，得到最佳護(hù)色劑配方，可改善杏酒的褐變問(wèn)題，為杏酒產(chǎn)品的褐變抑制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮杏果“凱特杏” 四川某杏果基地2019 年6 月采摘，該原料成熟度適中，果實(shí)飽滿且無(wú)病害；D254 諾盟酵母 法國(guó)LAFFORT 公司；異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸、EDTA-Na2、谷胱甘肽、氯化鈣 國(guó)產(chǎn)食品級(jí)添加劑。

JYZ-E3 九陽(yáng)原汁機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；T6 紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；UitraScan VIS 臺(tái)式色差儀 HunterLab（美國(guó)）有限公司；ME104E/02 電子分析天平 托利多儀器有限公司；STARTER 2C pH 計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；GZ-250-HS11 恒溫恒濕箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；精密膜過(guò)濾器 煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杏酒加工 杏果→清洗去核→破碎打漿→接種→發(fā)酵→過(guò)濾→添加護(hù)色劑→陳釀→精濾澄清→裝瓶

杏酒的發(fā)酵條件：調(diào)整杏漿料液比為4.5:1，初始糖度21%，接種1.2 g/L 的酵母，在25 ℃的條件下，發(fā)酵7 d。杏酒發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾，添加護(hù)色劑，于20 ℃的條件下放置15 d。再采用精濾設(shè)備進(jìn)行過(guò)濾，最后將果酒裝入消毒的空瓶中，加塞。在杏酒發(fā)酵結(jié)束到陳釀之間的過(guò)濾和轉(zhuǎn)移過(guò)程，最易發(fā)生氧化褐變現(xiàn)象，所以選擇此時(shí)研究添加護(hù)色劑的效果。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 杏酒發(fā)酵結(jié)束過(guò)濾后，保留部分酒樣做空白對(duì)照，再根據(jù)文獻(xiàn)查閱和預(yù)試驗(yàn)處理結(jié)果向其他酒樣中添加不同濃度的單一護(hù)色劑[13]：異抗壞血酸鈉（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），L-半胱氨酸（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L），植酸（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%），EDTA-Na2（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），谷胱甘肽（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），氯化鈣（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）。在20 ℃的條件下放置15 d，分別測(cè)定杏酒褐變抑制率和色差值，探究護(hù)色劑對(duì)杏酒褐變的抑制效果。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)六種護(hù)色劑進(jìn)行六因素二水平正交試驗(yàn)，以杏酒褐變抑制率和色差值為指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到影響杏酒褐變抑制率和色差值的主次順序，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)杏酒褐變影響最大的三種護(hù)色劑：異抗壞血酸鈉（A）、植酸（B）、L-半胱氨酸（C），根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的中心組合試驗(yàn)，以褐變抑制率和色差值為指標(biāo)，確定杏酒復(fù)合護(hù)色劑的最佳配比，因素水平見(jiàn)表2。

1.2.5 褐變度及褐變抑制率的測(cè)定 杏酒褐變度的測(cè)定參照Lopez-Toledano 等[14]的方法并稍作改進(jìn)，取待測(cè)酒樣上清液10 mL 作為待測(cè)樣品。利用紫外分光光度計(jì)，以蒸餾水為空白，在420 nm 處測(cè)定杏酒上清液的吸光度A，即杏酒褐變度。杏酒褐變抑制率（R）按照下式進(jìn)行計(jì)算：

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Variables and their levels used in orthogonal experimental design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and their levels designed in response surface design

式中：R 為褐變抑制率；A0為空白對(duì)照的杏酒褐變度；Am為護(hù)色劑處理后的杏酒褐變度。

1.2.6 色度的測(cè)定 采用色差儀測(cè)定杏酒的色度，以透射模式10°觀察模式測(cè)定樣品L*、a*、b*值；其中L*表示亮度值，a*表示綠紅值，b*表示藍(lán)黃值；用dE*（色差值）描述樣品的顏色變化，以發(fā)酵結(jié)束的杏酒為參比標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算色差值dE*，dE*越小表示待測(cè)樣品與參比樣品色澤越接近，反之則相差越大，計(jì)算公式如下[15]：

1.2.7 理化指標(biāo)的測(cè)定 酒精度：采用分光光度計(jì)法測(cè)定[16]，將5%的重鉻酸鉀與不同濃度的乙醇反應(yīng)后，利用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度（600 nm），繪制出酒精度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以此計(jì)算樣品的酒精度。

總酸、還原糖：根據(jù)GB/T 15038-2006[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析，并用OriginPro 2016 作圖；利用正交設(shè)計(jì)助手II V3.1 分析正交試驗(yàn)結(jié)果；利用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 異抗壞血酸鈉濃度對(duì)杏酒褐變的影響 異抗壞血酸鈉作為安全的食品添加劑，具有較強(qiáng)的還原性，可將體系中的醌類及其衍生物還原成無(wú)色的酚類物質(zhì)，防止醌類物質(zhì)聚合形成黑色素，從而達(dá)到抑制褐變的效果[18]。由圖1 所示，隨著異抗壞血酸鈉濃度的升高，色差值呈下降趨勢(shì)，而褐變抑制率呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。在異抗壞血酸鈉濃度為0.6 g/L 時(shí)，褐變抑制率達(dá)到最高，為47.83%，顯著高于其他濃度水平（P<0.05），與此同時(shí)，色差值下降趨勢(shì)也開(kāi)始逐漸放緩。原因可能在于，當(dāng)異抗壞血酸鈉濃度超過(guò)最佳范圍后，它將醌還原為酚的同時(shí)，多余的抗壞血酸也被氧化，并與氨基酸反應(yīng)導(dǎo)致非酶褐變的發(fā)生[19]。綜合考慮色差值和褐變抑制率，異抗壞血酸鈉最佳濃度范圍為0.6～0.8 g/L。

圖1 異抗壞血酸鈉的褐變抑制效果Fig.1 Effects of sodium isoascorbate on browning inhibition

2.1.2 L-半胱氨酸濃度對(duì)杏酒褐變的影響 半胱氨酸作為天然氨基酸，它能夠抑制褐變的主要機(jī)理在于其含有具還原性的巰基，能夠作為醌類物質(zhì)的螯合劑，與醌作用生成穩(wěn)定的無(wú)色化合物[20]。此外，它還可以直接作用于多酚氧化酶（PPO），降低其活性[21]。由圖2 所示，隨著L-半胱氨酸濃度的增大，杏酒的褐變抑制率先升高后穩(wěn)定，而色差值則呈先下降后上升的趨勢(shì)，可能是因?yàn)楫?dāng)濃度超過(guò)最佳范圍后，杏酒自身發(fā)生了非酶促褐變，導(dǎo)致顏色加深[22]。在L-半胱氨酸的濃度為1.2 g/L 時(shí)，色差值最小，為23.02，此時(shí)褐變抑制率也趨于穩(wěn)定，達(dá)到了45.58%。L-半胱氨酸雖具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但其具有氨基酸特有的味道，添加量過(guò)多會(huì)在一定程度上影響杏酒的香氣。綜合考慮色差值和褐變抑制率，L-半胱氨酸最佳濃度范圍為0.9～1.2 g/L。

圖2 L-半胱氨酸的褐變抑制效果Fig.2 Effects of L-cysteine on browning inhibition

2.1.3 植酸濃度對(duì)杏酒褐變的影響 植酸是從天然植物中提取的多功能食品添加劑，常作為果蔬護(hù)色劑，能與輔酶中的金屬離子發(fā)生螯合，抑制PPO 和POD 活性，減緩酶促褐變和非酶褐變的發(fā)生[23?24]；作為發(fā)酵促進(jìn)劑，可增加菌體生長(zhǎng)的酶系促進(jìn)產(chǎn)物的生成[25]；作為果酒的澄清劑，可阻止金屬離子參與蛋白質(zhì)、單寧等物質(zhì)的締合和絮凝[26]。由圖3 所示，隨著植酸濃度的增加，褐變抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，色差值呈先下降后上升的趨勢(shì)，說(shuō)明濃度過(guò)高的植酸會(huì)對(duì)褐變抑制造成負(fù)影響。當(dāng)植酸濃度為0.02%時(shí)，褐變抑制率達(dá)到最高，為40.51%，色差值則降至最低，為25.07。綜合考慮色差值和褐變抑制率，植酸最佳濃度范圍為0.02%～0.03%。

圖3 植酸的褐變抑制效果Fig.3 Effects of phytic acid on browning inhibition

2.1.4 EDTA-Na2濃度對(duì)杏酒褐變的影響 EDTANa2是一種含有羧基和氨基的螯合劑，通過(guò)螯合體系中對(duì)褐變反應(yīng)具有促進(jìn)作用的金屬離子，來(lái)達(dá)到抑制褐變的效果[12]。由圖4 所示，隨著EDTA-Na2濃度的增大，其褐變抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在0.4 g/L時(shí)達(dá)到最高，為41.57%；色差值呈先下降后上升的趨勢(shì)，在0.6 g/L 時(shí)降至最低，為24.98。EDTA-Na2的效果雖好，但其在水中的溶解度小，若在人體中不分解而排出，會(huì)造成人體缺鈣等現(xiàn)象[27]。綜合考慮色差值和褐變抑制率，EDTA-Na2最佳濃度范圍為0.4～0.6 g/L。

圖4 EDTA-Na2 的褐變抑制效果Fig.4 Effects of EDTA-Na2 on browning inhibition

2.1.5 谷胱甘肽濃度對(duì)杏酒褐變的影響 谷胱甘肽是一種抗氧化物質(zhì)，它抑制果酒褐變的機(jī)理在于它能夠與醌類化合物發(fā)生聚合物反應(yīng)[28]。也有研究表明[29?30]，它可以通過(guò)提高抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中谷胱甘肽還原酶的活性，加強(qiáng)體系中活性氧的清除能力，從而降低氧化脅迫。由圖5 所示，隨谷胱甘肽濃度的增加，杏酒的褐變抑制率先上升后下降，色差值先下降后上升，這與徐俊南[31]在研究蘋(píng)果酒時(shí)的結(jié)果相似。當(dāng)谷胱甘肽濃度為0.6 g/L 時(shí)，杏酒褐變抑制率達(dá)到最高，為36.94%；色差值降至最低，為26.53。綜合色差值和褐變抑制率并結(jié)合經(jīng)濟(jì)因素，谷胱甘肽的最佳濃度范圍為0.4～0.6 g/L。

圖5 谷胱甘肽的褐變抑制效果Fig.5 Effects of glutathione on browning inhibition

2.1.6 氯化鈣濃度對(duì)杏酒褐變的影響 目前對(duì)氯化鈣抑制褐變機(jī)理的解釋有兩種，一是氯化鈣對(duì)細(xì)胞壁及細(xì)胞膜完整性的保護(hù)，能增強(qiáng)組織的硬度，從而減少多酚類物質(zhì)外滲與酶類接觸[16,32]；二是Ca2+可競(jìng)爭(zhēng)性地螯合酶中的Cu2+，從而抑制褐變[33]。如圖6 所示，添加氯化鈣，杏酒的褐變抑制率普遍較低，在氯化鈣濃度為0.6 g/L 時(shí)達(dá)到最高，僅有26.24%；色差值先下降后趨于穩(wěn)定，在0.4 g/L 最低，為28.15，與濃度在0.6 g/L 時(shí)的色差值相比并無(wú)顯著性差異（P=0.142）。綜合色差值和褐變抑制率，氯化鈣的最佳濃度范圍為0.6～0.8 g/L。

圖6 氯化鈣的褐變抑制效果Fig.6 Effects of CaCl2 on browning inhibition

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將上述6 種護(hù)色劑選出兩個(gè)水平，然后以L8（27）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)極差分析，得到6 種不同護(hù)色劑對(duì)杏酒褐變抑制率與色差值影響的主次順序，發(fā)現(xiàn)影響杏酒褐變抑制率的主次順序?yàn)椋篈>C>B=E>D>F；影響杏酒色差值的主次順序?yàn)椋篈>B>C>D>E>F。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment design and results

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)杏酒褐變抑制率和色差值影響較大的3 種護(hù)色劑：異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，其設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。再對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，分析結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface test design and results

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)自變量編碼的因素A（異抗壞血酸鈉）、B（L-半胱氨酸）、C（植酸）進(jìn)行回歸分析并建立模型，可以得到一個(gè)二次多項(xiàng)式回歸方程：Y1（褐變抑制率，%）=49.73+1.62A?1.01B?1.72C+1.06AB?3.90AC+0.56BC?1.99A2?2.80B2?2.14C2

由表5 所示，回歸模型P值<0.0001，說(shuō)明該模型的回歸方程是極顯著的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。失擬項(xiàng)P值為 0.4018>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，無(wú)失擬因素存在。模型R2為 97.54%>85%，說(shuō)明模型的擬合程度較好，可用該回歸方程代替褐變抑制組合試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[34]。

表5 褐變抑制率回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance for regression model of browning inhibition rate

在回歸模型中，A、C，AC，A2、B2、C2對(duì)褐變抑制率影響為極顯著（P<0.01）；B 和AB 對(duì)褐變抑制率的影響顯著（P<0.05）；BC 的影響不顯著（P>0.05）。由此表明各個(gè)試驗(yàn)因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)自變量編碼的因素A（異抗壞血酸鈉）、B（L-半胱氨酸）、C（植酸）進(jìn)行回歸分析并建立模型，可以得到一個(gè)二次多項(xiàng)式回歸方程：Y2（色差值）=21.47?0.41A+1.38B+0.70C?0.79AB+1.43AC?0.20BC+2.17A2+1.56B2+1.74C2

由表6 所示，回歸模型極顯著（P=0.0003<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.9853>0.05），模型R2為 96.23%>85%，說(shuō)明模型的擬合程度較好，可利用該模型預(yù)測(cè)杏酒的護(hù)色劑配方。該模型中B，AC 和A2、B2、C2對(duì)色差值的影響是為極顯著（P<0.01）；C、AB 對(duì)色差值的影響顯著（P<0.05）；A、BC 對(duì)色差值影響不顯著（P>0.05）。

表6 色差值回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance for regression model of the chromatism

2.3.2 因素間的交互影響 根據(jù)各指標(biāo)與兩個(gè)自變量間的等高線和響應(yīng)面的形狀，可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，揭示交互項(xiàng)對(duì)杏酒褐變抑制率和色差值的影響。由圖7～圖8 可知，異抗壞血酸鈉（A）和半胱氨酸（B）的等高線偏圓形，響應(yīng)面較為陡峭，說(shuō)明AB 間的交互作用對(duì)杏酒褐變抑制率和色差值的影響達(dá)到顯著水平；異抗壞血酸鈉（A）和植酸（C）的等高線呈現(xiàn)橢圓形，響應(yīng)面更陡峭，說(shuō)明AC 間的交互作用非常顯著，且AC 的交互效應(yīng)對(duì)于杏酒褐變抑制率和色差值的影響程度較高，所以適當(dāng)調(diào)整A 和C 的含量，有利于提高杏酒的褐變抑制率，降低色差值。

圖7 異抗壞血酸鈉與L-半胱氨酸、植酸交互作用對(duì)杏酒褐變抑制率的影響Fig.7 Effects of the interaction of sodium isoascorbate with L-cysteine and phytic acid on the browning inhibition rate of apricot wine

圖8 異抗壞血酸鈉與L-半胱氨酸、植酸交互作用對(duì)杏酒色差值的影響Fig.8 Effects of the interaction of sodium isoascorbate with L-cysteine and phytic acid on the chromatism of apricot wine

2.3.3 最佳護(hù)色劑的確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)，得到最佳的杏酒護(hù)色劑配方為：異抗壞血酸鈉0.70 g/L、L-半胱氨酸1.13 g/L、植酸0.01%，在此條件下預(yù)測(cè)杏酒褐變抑制率為51.52%，色差值為21.42。考慮到試驗(yàn)的可操作性和可行性，確定最佳的杏酒護(hù)色劑配方為：抗壞血酸鈉0.70 g/L、L-半胱氨酸1.10 g/L、植酸0.01%。在此條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出杏酒的褐變抑制率為53.11%，色差值為22.35，相對(duì)誤差分別為：3.00%和4.16%，測(cè)得的酒精度為11.98%vol，還原糖為4.75 g/L，總酸為8.47 g/L，無(wú)護(hù)色劑添加的杏酒酒精度為12.15%vol，還原糖為4.63 g/L，總酸為8.87 g/L，兩者無(wú)顯著性差異。抑制結(jié)果與模型預(yù)測(cè)的理論值大致符合，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)所建立的回歸模型預(yù)測(cè)性良好，最佳護(hù)色劑配方可行，具有實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究分別選用6 種護(hù)色劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過(guò)分析褐變抑制率和色差值，發(fā)現(xiàn)不同護(hù)色劑對(duì)杏酒褐變的抑制效果差異較大，其中異抗壞血酸鈉的褐變抑制效果最佳。經(jīng)過(guò)6 因素2 水平的正交試驗(yàn)，并通過(guò)極差分析選擇對(duì)褐變抑制率和色差值影響最大的三種護(hù)色劑：異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸。通過(guò)采用響應(yīng)面法優(yōu)化護(hù)色劑配方，回歸方程擬合較好，最佳護(hù)色劑配方為：異抗壞血酸鈉0.70 g/L、L-半胱氨酸1.10 g/L、植酸0.01%。在此條件下，杏酒的酒精度為11.98%vol，還原糖為4.75 g/L，總酸為8.47 g/L，與對(duì)照組發(fā)酵的杏酒無(wú)顯著性差異，測(cè)得其褐變抑制率為53.11%，色差值為22.35，與預(yù)測(cè)值吻合率達(dá)到97.00%和95.84%。本文對(duì)杏酒護(hù)色劑的研究，為控制杏酒褐變提供了有效途徑，在今后的研究中，還可以從改善陳釀環(huán)境、加強(qiáng)非酶褐變的控制以及復(fù)合護(hù)色劑的互作機(jī)理等方面繼續(xù)進(jìn)行探究。