付亞玲，姚俊修，張仁堂,

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院/山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250014）

紅棗（Ziziphus jujubaMill.）又稱中華大棗，為鼠李科棗屬植物，在我國的栽培歷史已有4000 多年，主要在黃河中下游、西北和東部等地區(qū)分布[1]。紅棗富含微量元素、維生素和多糖、黃酮、三萜類、多酚、生物堿等活性成分，在補(bǔ)虛益氣、養(yǎng)血安神、健脾和胃等方面具有獨(dú)特功效[2?3]。黑化紅棗簡稱黑棗，是一種新型的紅棗深加工產(chǎn)品，在不添加任何添加劑的情況下通過控制溫度和濕度，由紅棗經(jīng)過一段時(shí)間的高溫熟化形成[4]。與原紅棗相比，黑棗在加工過程中顏色、香氣、風(fēng)味和營養(yǎng)成分發(fā)生各種物理化學(xué)變化，其生物活性物質(zhì)還原糖、三萜酸類、酚類和黃酮等含量升高，并且新產(chǎn)生一種脯氨酸[5]。因此，研究黑棗中活性成分，對(duì)其產(chǎn)品開發(fā)和綜合利用具有重要意義。

三萜酸類物質(zhì)為棗中非常重要的一類化學(xué)成分，由30 個(gè)碳原子（含6 個(gè)異戊二烯單元）聚合而成的萜類化合物[6]，具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8?9]、降血脂[10]、抗菌保肝[11]和提高機(jī)體免疫力[12]等重要生物作用，被廣泛應(yīng)用于新型功能食品、藥物、化妝品和保健品中。近年來，三萜酸類化合物的研究已成為天然產(chǎn)物開發(fā)的熱點(diǎn)，但大多數(shù)都集中在人參、靈芝等名貴中草藥材中，對(duì)棗中三萜酸類化合物的研究較少，目前國內(nèi)外僅限于天然棗果。另外，以黑化紅棗為試驗(yàn)材料并對(duì)其三萜酸類提取工藝及抗氧化分析相關(guān)性報(bào)道暫未見。

因此，本文以黑化后的紅棗為原料，利用超聲波法提取棗中三萜酸，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，并將粗提取物用大孔樹脂純化，進(jìn)而探究黑化紅棗三萜酸粗提物和純化物的體外抗氧化能力，旨在為黑化紅棗資源的研究和工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料大棗 品種為駿棗，產(chǎn)地新疆、山東泰安；黑化紅棗 實(shí)驗(yàn)室自制（選取無病蟲害、果形整齊的紅棗復(fù)水1 h 后裝袋密封，在溫度75 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱內(nèi)加工大約55 h，制得黑棗，其含水量26%左右，顏色呈黑褐色，口味酸甜。黑化后剪成細(xì)瓣，60 ℃烘箱中烘干，小型粉碎機(jī)粉碎，40 目過篩備用）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；2,2'-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 合肥博美生物科技有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%，上海源葉生物技術(shù)科技有限公司；香草醛、高氯酸、冰乙酸 均為分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

754N 紫外-可見分光光度計(jì) 上海奧譜勒儀器有限公司；KQ-500V 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；101-ZES 電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑化紅棗三萜酸的提取 精確稱取黑化紅棗粉末1.0 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入溶劑超聲輔助提取，提取完成后，抽濾，將抽濾后的溶液離心10 min（6000 r/min），然后殘?jiān)靥嵋淮?，合并兩次上清液，定容?00 mL 容量瓶中得樣品溶液，備用。

1.2.2 測定波長的確定 精密稱取10.00 mg 干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用無水乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，即為濃度0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取1 mL 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于具塞試管中，水浴揮干溶劑，依次加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL 高氯酸，混勻，60 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，取出后，立即用冷水冷卻至室溫，然后加入5 mL 冰乙酸，搖晃均勻，靜置10 min，以空白試劑為參比，在450～700 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，確定三萜酸最佳吸收波長[13]。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考蔡天嬌等[14]方法，略有改動(dòng)。向具塞試管中分別加入體積為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，水浴揮干溶劑，按照1.2.2 方法操作，在吸收光譜的最大波長處測定吸光度，以齊墩果酸溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 三萜酸提取量計(jì)算 分別精密吸取在不同條件下超聲提取的黑化紅棗樣品溶液0.1 mL 置于具塞試管中，按照1.2.2 方法操作，測定其在547 nm 處的吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算黑化紅棗中三萜酸的提取量，其計(jì)算公式見式（1）。

式中：C 為提取液中三萜酸的濃度，mg/mL；V 為三萜酸提取液的總體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為樣品粉末質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取一定量黑化紅棗粉末于具塞三角瓶中，按照設(shè)定條件進(jìn)行工藝提取，以三萜酸提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定液料比20:1 mL/g、提取溫度60 ℃、提取功率300 W、提取時(shí)間30 min，考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對(duì)黑化紅棗三萜酸提取效果的影響；固定乙醇濃度50%、提取溫度60 ℃、提取功率500 W、提取時(shí)間30 min，考察不同液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）對(duì)黑化紅棗三萜酸提取效果的影響；固定乙醇濃度50%、液料比20:1 mL/g、提取功率300 W、提取溫度60 ℃，考察不同超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對(duì)黑化紅棗三萜酸提取效果的影響；固定乙醇濃度50%、液料比20:1 mL/g、提取溫度60 ℃，提取時(shí)間30 min，考察不同超聲功率（100、200、300、400、500 W）對(duì)黑化紅棗三萜酸提取效果的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取對(duì)黑化紅棗三萜酸提取效果影響較大的乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間為自變量，并依次編碼為A、B、C，以三萜酸提取量（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of central composite design

1.2.7 三萜酸純化 將提取的黑化紅棗三萜酸粗樣品用D-101 型大孔樹脂進(jìn)行純化。按照1.0 mL/min的流速將配制好的三萜酸粗樣品溶液上柱，待樣液吸附后，以同樣的流速用去離子水沖去可溶性糖類等水溶性雜質(zhì)；然后先用40%乙醇進(jìn)行洗脫，再用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液以流速1.0 mL/min 進(jìn)行洗脫，收集95%乙醇洗脫液[15]。將洗脫液中乙醇旋蒸濃縮后冷凍干燥，得到三萜酸干燥粉末，用于抗氧化活性的測定。

1.2.8 黑化紅棗三萜酸純化前后抗氧化活性研究

1.2.8.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考Fu 等[16]方法略有修改，用移液槍分別吸取不同濃度的樣品溶液2 mL 置于試管中，加入2 mL DPPH（0.1 mmol/L，無水乙醇配制）溶液，振蕩搖勻后，室溫黑暗處反應(yīng)30 min，在517 nm 波長下測定其吸光度A1；同時(shí)將等量乙醇代替DPPH 溶液測按照上述測定方法其吸光度為A2；再測定2 mL 無水乙醇和2 mL DPPH 混合溶液的吸光度A0。以VC為陽性對(duì)照，按照式（2）計(jì)算DPPH 自由基清除率：

1.2.8.2 ABTS+·清除能力測定 參考Liu 等[17]方法有所改動(dòng)。ABTS 工作液是由7 mmol/L 的ABTS溶液與2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫避光條件下反應(yīng)12～16 h 制得，使用前用乙醇稀釋混合液，直到測得其在734 nm 處的吸光度為0.7±0.02。在6 支試管中依次加入不同濃度的樣品溶液0.5 mL、ABTS 工作液3 mL，振蕩均勻，黑暗下反應(yīng)8 min，檢測其在波長734 nm 處的吸光值A(chǔ)1；去離子水代替ABTS 工作液測得吸光值A(chǔ)2；同樣用去離子水代替樣品溶液測其吸光值A(chǔ)0，以VC作為陽性對(duì)照。根據(jù)式（3）計(jì)算ABTS 自由基清除率。

1.2.8.3 總還原能力測定 參考康寧等[18]的方法稍有修改，吸取適當(dāng)稀釋的樣品溶液1.0 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）和2.5 mL 鐵氰化鉀溶液（1%，w/v），在50 ℃下水浴反應(yīng)20 min。取出后，加入2.5 mL 10%（w/v）的三氯乙酸，搖勻，離心，隨后加入2.5 mL 去離子水及0.1%（w/v）三氯化鐵溶液0.5 mL，渦旋混勻，靜置10 min，測定反應(yīng)體系在波長700 nm 處吸光度A1，以VC作為陽性對(duì)照?？傔€原能力計(jì)算公式見式（4）：

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excle 2016 和Origin 2018 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖；響應(yīng)面試驗(yàn)運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析和設(shè)計(jì)。所有試驗(yàn)平行測定3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

波長掃描結(jié)果如圖1 所示，齊敦果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最大吸收峰在1 處（547 nm），因此，選擇547 nm作為三萜酸的測定波長。

圖1 齊墩果酸吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrogram of oleanolic acid

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示，其線性回歸方程為Y=0.0409X?0.01，R2=0.9989，表明齊墩果酸溶液在0～20 μg/mL 范圍內(nèi)吸光值與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同乙醇濃度對(duì)三萜酸提取量的影響 由圖3可看出，當(dāng)乙醇濃度在40%～50%之間時(shí)，黑化紅棗中三萜酸提取量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在50%處其提取量達(dá)到最高值1.176 mg/g；但當(dāng)乙醇濃度超過50%后，三萜酸提取量隨著乙醇濃度的升高反而下降。原因可能是乙醇濃度提高，使黑變紅棗中一些醇溶性雜質(zhì)、色素等成分溶出量增加[19]，從而影響三萜酸提取量，因此乙醇濃度選擇50%最佳。研究結(jié)果與張瓊等[20]采用超聲法提取“魯棗1 號(hào)”棗果中三萜酸的提取量和乙醇濃度關(guān)系結(jié)果一致。

圖3 乙醇濃度對(duì)三萜酸提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of triterpenoid acid

2.3.2 液料比對(duì)三萜酸提取量的影響 由圖4 可知，黑化紅棗三萜酸提取量隨著液料比增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為20:1 mL/g 時(shí)，三萜酸提取量達(dá)到最大值1.286 mg/g。分析原因可能是液料比過小時(shí)，固液兩相濃度梯度小，阻礙超聲波在溶劑中擴(kuò)散，不利于三萜酸有效物質(zhì)全部溶出[21]，因此三萜酸含量較小；當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，物料與溶劑接觸面積增加，三萜酸逐漸全部溶出，故目標(biāo)分析物提取量增加[22]；但當(dāng)溶劑量過多會(huì)形成稀釋效應(yīng)，溶液中雜質(zhì)也會(huì)隨之增多，從而提取量下降[22?23]。綜合考慮，液料比選擇20:1 mL/g 為宜。

圖4 液料比對(duì)三萜酸提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on yield of triterpenoid acid

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)三萜酸提取量的影響 由圖5 可知，超聲時(shí)間小于30 min 時(shí)，隨時(shí)間增加黑化紅棗三萜酸提取量不斷上升，并且增加幅度相對(duì)較大，原因可能是由于在一定范圍內(nèi)，超聲時(shí)間越長，超聲波的空化作用和機(jī)械作用加速物料與溶劑充分接觸[24]，使三萜酸越容易溶出。當(dāng)超聲時(shí)間超過30 min 之后三萜酸提取量隨時(shí)間增加而逐漸降低，出現(xiàn)此現(xiàn)象可能因超聲時(shí)間過長，破壞了三萜酸的結(jié)構(gòu)[25]，或是溶出的雜質(zhì)增多，從而影響了提取效果。故選擇30 min為最佳超聲時(shí)間，此時(shí)其提取量為1.299 mg/g。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)三萜酸提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on yield of triterpenoid acid

2.3.4 超聲功率對(duì)三萜酸提取量的影響 由圖6 可以看出，超聲功率在100～300 W 內(nèi)三萜酸含量緩慢上升，當(dāng)超聲功率達(dá)到300 W 時(shí)三萜酸含量達(dá)到最高值1.193 mg/g，之后隨著功率的增大含量稍有降低。這可能是由于超聲功率過大使溶液中溫度過高，造成目標(biāo)物活性改變，同時(shí)產(chǎn)生的空化氣泡增長過大，降低了空化作用的效果，阻礙超聲波的傳播[26]，從而導(dǎo)致提取量降低。因此，選擇超聲功率為300 W。

圖6 超聲功率對(duì)三萜酸提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on yield of triterpenoid acid

2.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 建立回歸模型及方差分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出，超聲功率對(duì)黑化紅棗三萜酸提取量的影響與其他三個(gè)因素相比較小，因此沒有必要將其作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素。根據(jù)Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（C）3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表3 所示。采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

從表3 可看出，該回歸模型的P<0.0001，說明模型是極顯著；失擬項(xiàng)P=0.8991>0.05，失擬不顯著，表示該模型對(duì)本試驗(yàn)擬合程度良好，在試驗(yàn)中產(chǎn)生的誤差較??；模型的決定系數(shù)R2=0.9754，說明三萜酸提取量的變化有97.54%來自于所選試驗(yàn)因素，因此該回歸方程可以很好地描述各試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系；校正決定系數(shù)RAdj2=0.9438，表明該模型能解釋94.38%響應(yīng)值的變化；模型變異系數(shù)CV=2.59%，說明重現(xiàn)性好，可用于黑化紅棗三萜酸提取含量的分析和預(yù)測?；貧w方程各項(xiàng)方差中一次項(xiàng)B，二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均小于 0.01，影響達(dá)到極顯著；交互項(xiàng)因素AC、BC 影響顯著（P<0.05），AB 項(xiàng)不顯著（P>0.05），這表明試驗(yàn)因素與黑化紅棗三萜酸提取量之間不是簡單的線性關(guān)系。通過比較F值可知，影響黑化紅棗三萜酸提取量的各因素由大到小為B>A>C，即液料比>乙醇濃度>超聲時(shí)間。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression equation

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析 為了更直觀地反映出兩兩因素交互作用對(duì)三萜酸提取效果的影響，根據(jù)回歸方程繪制出其響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果如圖7所示。

圖7 各因素交互作用響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors

各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響程度的強(qiáng)弱與響應(yīng)面坡度和等高線密集度有關(guān)。響應(yīng)面坡度越陡峭，則黑化紅棗三萜酸提取量受兩兩因素交互作用影響就越大，反之，影響就越??；等高線密集呈橢圓形，說明其交互作應(yīng)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，等高線稀疏呈圓形，則表示其交互效應(yīng)不顯著[27]。由圖7 可以看出，BC 交互作用的響應(yīng)曲面坡度最陡峭，且其等高線圖橢圓率高，表明液料比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)黑化紅棗三萜酸提取量影響最顯著（P<0.01）；乙醇濃度（A）和超聲時(shí)間（C）影響相對(duì)顯著（P<0.05），曲面較為陡峭，等高線圖為橢圓形；AB 影響次之，即乙醇濃度和液料比，表現(xiàn)為曲面坡度變化較緩，且等高線圖橢圓形狀不明顯，說明兩者交互作用不顯著。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件模型分析得出，黑化紅棗三萜酸最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度49.80%、液料比22.73:1 mL/g、超聲時(shí)間31.15 min，此時(shí)三萜酸提取量理論預(yù)測值為1.300 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的方便性，將黑化紅棗三萜酸提取條件調(diào)整為：乙醇濃度50%、液料比23:1 mL/g、超聲時(shí)間30 min，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)3 次，測得三萜酸提取量為1.313±0.01 mg/g，其RSD 為0.76%，結(jié)果與預(yù)測的理論相近，表明模型擬合良好，方法具有可行性。

2.6 黑化紅棗三萜酸純化結(jié)果

通過采用D-101 型大孔樹脂對(duì)提取物進(jìn)行初步純化，結(jié)果得出，黑化紅棗三萜酸粗提物與純化物的純度分別23.55%±0.60%和58.77%±0.52%，約為純化前2.49 倍，表明該方法有效可行，適于黑化紅棗三萜酸的純化。

2.7 抗氧化分析

2.7.1 DPPH 自由基清除能力 由圖8 可知，黑化紅棗三萜酸粗提物、純化物和VC都有清除DPPH 自由基的能力，并且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在濃度0.5～1.5 mg/mL 范圍內(nèi)，粗提物對(duì)DPPH 的清除率仍保持著不斷增加的趨勢(shì)，而純化物和VC增加趨勢(shì)趨于平緩。當(dāng)濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，三萜酸純化物對(duì)DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值95.03%±0.83%，但稍弱于VC（97.10%±0.53%），與兩者相比三萜酸粗提物效果最差，其清除率最高值為86.00%±0.30%。經(jīng)線性擬合，黑化紅棗三萜酸粗提物和純化物對(duì)DPPH 自由基的IC50值分別為0.571、0.053 mg/mL，表明經(jīng)純化后三萜酸清除DPPH 自由基能力顯著（P<0.05）高于純化前。

圖8 三萜酸DPPH 自由基清除效果Fig.8 DPPH radical scavenging effect of triterpenic acids

2.7.2 ABTS 自由基清除能力 從圖9 可以看出，隨著濃度的增加，黑化紅棗粗提物、純化物和VC都表現(xiàn)出較好的清除ABTS+·能力。在低濃度時(shí)，粗提物和純化物抗氧化能力明顯低于VC，尤其是粗提物。當(dāng)質(zhì)量濃度從0.01 mg/mL 上升到0.25 mg/mL 時(shí)，VC的清除率由46.50%±0.92%增至98.70%±0.60%，黑化紅棗三萜酸粗提物和純化物的清除率分別從5.70%±0.87%、12.67%±0.70%增至59.53%±0.93%、99.03%±0.52%。在質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 時(shí)，三萜酸純化物的清除效果稍高于VC，且顯著（P<0.05）高于粗提取物。經(jīng)線性擬合，其清除ABTS+·的IC50值分別為0.186、0.059 mg/mL，這說明黑化紅棗三萜酸經(jīng)過純化后清除ABTS+·的能力增強(qiáng)。

圖9 三萜酸ABTS 自由基清除效果Fig.9 ABTS+· scavenging effect of triterpenic acids

2.7.3 總還原力 由圖10 可以得出，在一定范圍內(nèi)，黑化紅棗三萜酸粗提物、純化物和VC的總還原能力都隨濃度的增加而增大，樣品濃度與活性呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。當(dāng)濃度增加到1.0 mg/mL 后，VC上升的趨勢(shì)減緩。由圖可知，兩者與VC的還原能力排序?yàn)椋篤C>純化物>粗提物，且三者在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，總還原力分別達(dá)到最高值1.356、1.131 及0.72。表明黑化紅棗三萜酸粗提物和純化物具有一定的還原能力，但它的作用效果整體還是弱于VC。

圖10 三萜酸總還原力測定Fig.10 Determinatim of FRAP value of triterpenic acids

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取黑化紅棗三萜酸條件進(jìn)行了優(yōu)化分析，并從二次回歸模型方差分析對(duì)影響三萜酸提取量的因素之間相互作用進(jìn)行了探討，結(jié)果得出，液料比和超聲時(shí)間影響極顯著，乙醇濃度和超聲時(shí)間交互作用顯著，其余不顯著；最佳提取工藝為：乙醇濃度50%、液料比23:1 mL/g、超聲時(shí)間30 min、超聲功率300 W，在此條件下黑化紅棗三萜酸提取量達(dá)到了1.313±0.01 mg/g，與預(yù)測值結(jié)果相接近。說明此優(yōu)化工藝參數(shù)可靠，提取效率高，操作簡單可行。

通過抗氧化試驗(yàn)可知，黑化紅棗三萜酸粗提物和純化物對(duì)DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除能力及總還原能力有較好的抗氧化活性，其對(duì)DPPH·清除率的IC50值分別為0.571、0.053 mg/mL，對(duì)ABTS+·清除率的IC50值分別為0.186、0.059 mg/mL，總還原力則隨樣品濃度升高而增大，經(jīng)大孔樹脂純化后三萜酸抗氧化能力強(qiáng)于粗提物，說明其可作為天然的抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)初步研究了黑化紅棗三萜酸提取及抗氧化活性，對(duì)于黑化前后紅棗三萜酸的含量變化及組成特性尚未明確，因此，研究紅棗黑化前后三萜酸變化特性及機(jī)理是今后需要解決的問題之一，為黑化紅棗加工利用提供理論支撐，同時(shí)提高紅棗產(chǎn)業(yè)原料的附加值。