王 琦 司亞鑫 楊 田 高熒羲 高曉鋒 朱 彬 馬春蕾

(太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，太原 030008)

0 引言

硫普羅寧(tiopronin，TPN)是一種人工合成的氨基硫醇，它是臨床上治療胱氨酸尿癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肝紊亂等疾病的重要藥物[1-3]。此外，由于TPN分子中存在活性巰基，其具有消除自由基、抵抗氧化壓力的作用[4-5]，而巰基與重金屬離子的結(jié)合作用，也使得其成為一種臨床上常用的解毒劑[6-7]。TPN的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 TPN的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of TPN

然而，過(guò)量地服用或不當(dāng)?shù)厥褂肨PN也可能會(huì)引起諸如腸胃不適、味覺(jué)失靈、肌無(wú)力、尿蛋白等副作用[8-10]。因此，建立便捷、靈敏的分析方法來(lái)測(cè)定生物體液中的TPN含量具有重要意義。截至目前，研究者們?cè)O(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了眾多測(cè)定TPN的方法，包括高效液相色譜法[11-12]、電化學(xué)測(cè)定法[13]、化學(xué)發(fā)光法[14]、分光光度法[15]、磷光光譜法[16]、熒光光譜法[17-18]等。其中，熒光分析法由于快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)備受青睞。

二氧化錳納米材料(Nano-MnO2)具有低成本、高比表面積、摩爾消光系數(shù)大、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[19-21]。此外，Nano-MnO2還具有優(yōu)開(kāi)的光吸收性能和快速電子轉(zhuǎn)移能力，這就賦予了它們作為熒光猝滅劑高效猝滅熒光的能力[22]?；诖?，多種MnO2納米材料被開(kāi)發(fā)并與熒光材料構(gòu)建復(fù)合熒光體系，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)、靜態(tài)猝滅效應(yīng)(static quenching effect，SQE)和內(nèi)濾效應(yīng)(inner filter effect，IFE)等途徑實(shí)現(xiàn)了熒光猝滅[23-25]。另一方面，活性巰基能夠與MnO2發(fā)生特開(kāi)性的氧化還原反應(yīng)，使得后者降解為錳離子[26-28]，失去了MnO2的性能，這就為基于MnO2的熒光復(fù)合體系提供了新穎的傳感模式。

基于上述研究，我們以聚烯丙胺鹽酸鹽(PAH)為反應(yīng)底物，通過(guò)一步水熱法制備了熒光碳點(diǎn)(carbon dots，CDs)，基于高錳酸鉀處理納米材料的技術(shù)[29]，在CDs溶液中加入高錳酸鉀，通過(guò)原位氧化還原反應(yīng)制備得到了CDs-MnO2納米復(fù)合材料。MnO2通過(guò)SQE和IFE有效地猝滅了CDs的熒光，而在復(fù)合體系中引入TPN后，由于后者分子中活性巰基與MnO2的特開(kāi)反應(yīng)，MnO2被降解進(jìn)而使熒光恢復(fù)。由此建立了基于CDs-MnO2的熒光傳感模式測(cè)定TPN的新方法。該MnO2調(diào)控的熒光開(kāi)關(guān)傳感原理被首次用于TPN的測(cè)定，這對(duì)TPN的分析檢測(cè)是一個(gè)有效的補(bǔ)充。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

PAH(95%)、TPN(98%)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；高錳酸鉀及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)中用水均為二次去離子水；尿液樣品來(lái)自健康的志愿者，測(cè)定前過(guò)濾并稀釋50倍。

所用儀器有：透射電子顯微鏡(Talos F200X，美國(guó)Thermo Scientific公司，加速電壓200 kV、功率5 kW)；X射線光電子能譜儀(XSAM 800，英國(guó)Kratos公司，激發(fā)光源 AlKα)；納米粒度儀(ZS90，英國(guó) Malvern公司)；熒光光譜儀(F-7000，日本Hitachi公司，激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，狹縫寬度5 nm)；紫外-可見(jiàn)光譜儀(TU-1901，中國(guó)普析公司)；瞬態(tài)熒光光譜儀(FLS 1000，英國(guó)Edinburgh公司)。

1.2 CDs和CDs-MnO2納米復(fù)合材料的制備

以PAH為反應(yīng)底物，通過(guò)一步水熱法制備熒光CDs。首先，取1 g PAH粉末溶于100 mL水中，完全溶解后轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在180℃下反應(yīng)2 h。然后，將得到的淡黃色溶液冷卻后轉(zhuǎn)移至節(jié)流分子量為3 500 kDa的透析袋中，在去離子水中透析24 h進(jìn)一步純化產(chǎn)物溶液。最后，將得到的CDs溶液保存在冰箱中備用。

CDs-MnO2納米復(fù)合材料通過(guò)原位的氧化還原反應(yīng)制備而得。首先，取上述CDs溶液10 mL，在攪拌的條件下逐滴加入0.5 mL濃度為10 mmol·L-1的高錳酸鉀溶液，持續(xù)攪拌反應(yīng)10 min。然后將得到的棕色溶液轉(zhuǎn)移入節(jié)流分子量3 500 kDa的透析袋中，在去離子水中透析24 h純化。最后將得到的產(chǎn)品溶液保存在冰箱中備用。

1.3 熒光檢測(cè)TPN

基于CDs-MnO2納米復(fù)合材料的熒光檢測(cè)TPN在pH=5的HAc-NaAc緩沖液中測(cè)定。將上述100 μL CDs-MnO2溶液加入到 800 μL pH=5 的緩沖液中，混勻后立即加入100 μL不同濃度的TPN溶液或去離子水(作為空白對(duì)照)中，混勻后測(cè)定其在380 nm激發(fā)下440 nm處的熒光強(qiáng)度。熒光光譜儀的狹縫寬度設(shè)置為5 nm。所有的測(cè)試全部平行測(cè)定3次。

1.4 尿液樣品的檢測(cè)

取100 μL制備好的CDs-MnO2溶液加入到700 μL pH=5的緩沖液中，再加入100 μL尿液樣品和100 μL已知濃度的TPN溶液(5、15、60 μmol·L-1)中，保持最終體積為1 mL?；靹蚝鬁y(cè)定所得樣品溶液在380 nm激發(fā)下440 nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算其加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs和CDs-MnO2納米復(fù)合材料的表征

通過(guò)TEM表征制備所得的CDs和CDs-MnO2納米復(fù)合材料的形貌。如圖2A所示，均勻分散的CDs小顆粒表明了其尺寸在5 nm以下且呈現(xiàn)球形。而圖2B中CDs-MnO2的尺寸則明顯變大且有一定程度的團(tuán)聚。插圖分別是CDs溶液和CDs-MnO2溶液的照片，可以看出淡黃色的CDs在復(fù)合MnO2納米材料后溶液變?yōu)樽厣榱搜芯窟@2種納米材料的尺寸分布，分別測(cè)試了兩者的納米粒度分布(圖2C和2D)。結(jié)果表明，CDs的尺寸處于3.12～7.53 nm的范圍之內(nèi)，其平均粒度為4.33 nm；而CDs-MnO2的尺寸處于21.04～50.75 nm的范圍之內(nèi)，其平均粒度為29.74 nm。上述結(jié)果表明，以PAH為反應(yīng)底物，通過(guò)水熱法成功制備了CDs，且基于高錳酸鉀的氧化還原反應(yīng)，成功得到了CDs-MnO2納米復(fù)合材料。

圖2 (A)CDs和(B)CDs-MnO2納米復(fù)合材料的TEM圖,插圖為相應(yīng)溶液的照片;(C)CDs和(D)CDs-MnO2納米復(fù)合材料的納米粒度分布圖Fig.2 (A)TEM images of CDs and CDs-MnO2 nanocomposite,insets are corresponding photos;Nanoparticle particle size distribution curves of(C)CDs and(D)CDs-MnO2 nanocomposite

進(jìn)一步通過(guò)XPS研究了CDs和CDs-MnO2納米復(fù)合材料的元素組成。CDs的XPS全譜圖中可觀察到 C1s、N1s、O1s的特征峰(圖 3A)，證明 CDs是由 C、N、O元素組成。而在CDs的基礎(chǔ)上，CDs-MnO2的XPS全譜圖(圖3B)中明顯地出現(xiàn)了Mn2p的特征峰，證明了MnO2的復(fù)合。圖3C～3F依次為CDs-MnO2中Mn2p、O1s、C1s、N1s的高分辨XPS譜圖。Mn2p擬合譜圖中(圖3C)位于653.8和642.3 eV處的2個(gè)峰對(duì)應(yīng)Mn2p1/2和 Mn2p3/2的特征峰[23]。在 O1s的擬合譜圖(圖3D)中，可以觀察到532.2、531.0和529.7 eV三個(gè)分峰，分別對(duì)應(yīng)C—O—H/C—O—C、Mn—O—H、Mn—O—Mn的結(jié)合形式[28]。C1s的擬合譜圖(圖3E)表明，C有3種不同的結(jié)合形式，即O＝C—OH(288.2 eV)、C—N(285.6 eV)、C—C(284.7 eV)[23]。N1s的擬合譜圖(圖3F)在401.2和399.1 eV處出現(xiàn)了分峰，分別源自于N—(C)3和C—N—C[23]。

圖3 (A)CDs和(B)CDs-MnO2的XPS全譜圖;CDs-MnO2的(C)Mn2p、(D)O1s、(E)C1s和(F)N1s高分辨XPS譜圖Fig.3 XPS full scan spectra of(A)CDs and(B)CDs-MnO2;(C)Mn2p,(D)O1s,(E)C1s and(F)N1s high resolution XPS spectra of CDs-MnO2

2.2 TPN對(duì)CDs-MnO2熒光性能的影響

圖4A為CDs-MnO2納米復(fù)合材料的制備及熒光傳感TPN的示意圖。如圖所示，由PAH制備而得的CDs與高錳酸鉀反應(yīng)后生成了CDs-MnO2納米復(fù)合材料，且MnO2有效地猝滅了CDs熒光；TPN加入后與MnO2發(fā)生氧化還原反應(yīng)使其降解，猝滅劑消失從而熒光得以恢復(fù)?；谶@種傳感原理，建立了以MnO2納米材料調(diào)控?zé)晒獾姆椒▉?lái)測(cè)定TPN。圖4B所示為CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在380 nm激發(fā)下的熒光光譜。從圖中可知，CDs表現(xiàn)出了優(yōu)開(kāi)的熒光性能，而CDs的熒光在復(fù)合MnO2后明顯地減弱，進(jìn)一步加入TPN降解MnO2后熒光又表現(xiàn)出一定程度的恢復(fù)。從圖4C中三者在365 nm紫外燈照射下的照片能夠直觀地觀察到溶液體系藍(lán)色熒光的降低和恢復(fù)。

圖4 (A)CDs-MnO2納米復(fù)合材料的制備及熒光傳感TPN的示意圖;(B)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液的熒光光譜圖;(C)CDs(1)、CDs-MnO2(2)、CDs-MnO2+TPN(3)溶液在365 nm的紫外燈照射下的照片F(xiàn)ig.4 (A)Scheme of synthesis of CDs-MnO2 and fluorescent sensing of TPN;(B)Fluorescence spectra of CDs,CDs-MnO2 nanocomposite and CDs-MnO2+TPN;(C)Photographs of CDs(1),CDs-MnO2(2)and CDs-MnO2+TPN(3)solutions under UV(365 nm,center)illumination

2.3 熒光傳感機(jī)理研究

為了研究MnO2猝滅CDs熒光和TPN恢復(fù)熒光的機(jī)理，我們測(cè)試了 CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在440 nm處的時(shí)間分辨熒光衰減光譜(圖5A)。通過(guò)多指數(shù)熒光衰減擬合數(shù)據(jù)可知(表1)，CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN的熒光壽命分別是4.33、4.66、4.81 ns。該結(jié)果表明，在復(fù)合MnO2前后及CDs-MnO2與TPN反應(yīng)前后，CDs的熒光壽命并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，這說(shuō)明MnO2對(duì)CDs的熒光猝滅機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅[30]。此外，圖5B對(duì)比了CDs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖以及CDs-MnO2納米復(fù)合材料的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。結(jié)果表明，MnO2在240～600 nm出現(xiàn)了寬的吸收峰，這與CDs的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜有較大程度的重疊，這就說(shuō)明IFE也對(duì)CDs的熒光猝滅起一定作用[31]。因此，MnO2對(duì)CDs的熒光猝滅是由SQE和IFE共同引起的。

表1 多指數(shù)熒光衰減擬合參數(shù)aTable 1 Fitting parametersa of multi-exponential to the fluorescence decay

另一方面，我們研究了TPN刺激的熒光恢復(fù)機(jī)理，如圖5C所示，復(fù)合MnO2之后，復(fù)合材料在240～600 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)了新的吸收帶。加入TPN之后，由于其與MnO2的氧化還原反應(yīng)，使得MnO2降解、消失，光譜圖上也表現(xiàn)出寬吸收帶的消失。從圖5D中的照片能直觀地看出，復(fù)合MnO2之后，溶液顏色變?yōu)樽厣尤隩PN后棕色消失，也證明了MnO2被還原降解。因此，該熒光體系的熒光恢復(fù)機(jī)理是TPN刺激下的氧化還原反應(yīng)造成了猝滅劑降解、消失。

圖5 (A)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2-TPN的時(shí)間分辨熒光衰減光譜圖;(B)CDs的熒光激發(fā)、熒光發(fā)射和CDs-MnO2的紫外-可見(jiàn)吸收的光譜重疊對(duì)照?qǐng)D;(C)CDs、CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖;(D)CDs(1)、CDs-MnO2(2)和 CDs-MnO2+TPN(3)溶液的照片F(xiàn)ig.5 (A)Time-resolved fluorescence decay spectra of CDs,CDs-MnO2 and CDs-MnO2+TPN;(B)Spectral overlap of fluorescence excitation and emission spectra of CDs and UV-Vis absorption of CDs-MnO2;(C)UV-Vis absorption spectra of CDs,CDs-MnO2and CDs-MnO2+TPN;(D)Photos of CDs(1),CDs-MnO2(2)and CDs-MnO2+TPN(3)solutions

2.4 熒光測(cè)定TPN的條件參數(shù)優(yōu)化

基于上述研究，TPN具有刺激MnO2分解引起熒光恢復(fù)的性能，因此CDs-MnO2納米復(fù)合材料能夠用于TPN的分析測(cè)定。由于MnO2的原位生成，熒光猝滅在生成MnO2的同時(shí)就已實(shí)現(xiàn)，響應(yīng)時(shí)間由TPN與MnO2的反應(yīng)時(shí)間決定。圖6A考察了加入TPN后，CDs-MnO2體系的熒光光譜變化。如圖所示，加入TPN后，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，最后趨于平穩(wěn)。圖6B為加入TPN后不同時(shí)間下的熒光恢復(fù)效率(F/F0，其中F0指的是CDs-MnO2的初始熒光強(qiáng)度，F(xiàn)指加入TPN后CDs-MnO2體系的熒光強(qiáng)度)。由圖可知，反應(yīng)1 min后熒光恢復(fù)基本趨于穩(wěn)定。因此，CDs-MnO2可以快速檢測(cè)TPN。此外，體系的pH值會(huì)影響TPN與MnO2的氧化還原反應(yīng)，是影響TPN測(cè)定的關(guān)鍵因素。如圖6C所示，我們分別測(cè)定了CDs-MnO2納米復(fù)合材料及CDs-MnO2+TPN在不同pH值的HAc-NaAc緩沖液中的熒光強(qiáng)度。圖6D為不同pH值條件下TPN對(duì)CDs-MnO2納米復(fù)合體系的熒光恢復(fù)效率。由圖6C、6D可知，當(dāng)體系pH=5時(shí)，熒光恢復(fù)效率最佳。因此，為了后續(xù)靈敏度實(shí)驗(yàn)，我們選擇該酸度作為測(cè)定TPN的最佳條件。

圖6 (A)在TPN加入后CDs-MnO2在不同時(shí)間下的熒光光譜圖;(B)不同時(shí)間下TPN對(duì)CDs-MnO2的熒光恢復(fù)效率;(C)CDs-MnO2、CDs-MnO2+TPN溶液在不同pH值下的熒光強(qiáng)度;(D)不同pH值下TPN對(duì)CDs-MnO2的熒光恢復(fù)效率Fig.6 (A)Fluorescence spectra of CDs-MnO2 at different times after addition of TPN;(B)Fluorescence recovery efficiency of CDs-MnO2 by TPN at different times;(C)Fluorescence intensity of CDs-MnO2 and CDs-MnO2+TPN solutions under different pH values;(D)Fluorescence recovery efficiency of CDs-MnO2 by TPN under different pH values

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和選擇性

在TPN的最佳響應(yīng)條件(pH=5)下，測(cè)定了不同濃度的TPN對(duì)CDs-MnO2納米復(fù)合體系的熒光恢復(fù)效率(圖7A)。結(jié)果表明，體系的熒光恢復(fù)效率與TPN 的濃度在 0.2～80 μmol·L-1的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且符合線性方程F/F0=1.064 8+0.005 9c(R2=0.997 5)，其中c是 TPN的濃度(μmol·L-1)，檢出限為0.11 μmol·L-1(3σ/S，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為檢測(cè)靈敏度)。此外，考察了CDs-MnO2納米復(fù)合熒光體系測(cè)定TPN的選擇性(圖7B)。如圖7B所示，TPN表現(xiàn)出明顯的熒光恢復(fù)，而其余可能共存的金屬離子和代謝產(chǎn)物在與TPN相同濃度時(shí)，并未對(duì)CDs-MnO2納米復(fù)合熒光體系產(chǎn)生恢復(fù)。該結(jié)果證明CDs-MnO2對(duì)TPN的測(cè)定具有良好的選擇性。需要指出的是，其他含巰基基團(tuán)的生物分子如谷胱甘肽也能對(duì)CDs-MnO2納米復(fù)合熒光體系產(chǎn)生響應(yīng)[28]，然而，有報(bào)道稱尿液樣品中并不含有此類生物分子[32]，且生物巰基分子的干擾能夠通過(guò)稀釋樣品而消除[16]。因此實(shí)際樣品檢測(cè)中能夠避免其他含巰基基團(tuán)分子的干擾。

圖7 (A)CDs-MnO2測(cè)定TPN的標(biāo)準(zhǔn)曲線;(B)CDs-MnO2測(cè)定TPN的選擇性Fig.7 (A)Linear calibration plot for TPN determination based on CDs-MnO2;(B)Selectivity of CDs-MnO2 for TPN detection

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

由于CDs-MnO2具有良好的測(cè)定TPN的性能，該納米復(fù)合熒光體系可用于實(shí)際人體尿液樣品中TPN含量的測(cè)定，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，該方法中樣品的加標(biāo)回收率在97.57%～102.58%范圍之內(nèi)，證明了CDs-MnO2納米復(fù)合熒光體系在實(shí)際樣品中測(cè)定TPN具有一定的可靠性。

表2 尿液樣品中TPN含量的測(cè)定Table 2 Determination of TPN in human urine sample

3 結(jié) 論

通過(guò)PAH水熱法制備得到了熒光CDs，并利用原位的氧化還原反應(yīng)制備了CDs-MnO2納米復(fù)合材料。通過(guò)靜態(tài)猝滅效應(yīng)和內(nèi)濾效應(yīng)，MnO2有效地猝滅了CDs熒光；進(jìn)一步地，由于TPN的活性巰基與MnO2的氧化還原作用，使得MnO2降解、消失，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù)?；诖?，建立了MnO2調(diào)控的熒光傳感體系來(lái)測(cè)定TPN。該納米材料的制備方法簡(jiǎn)單便捷，熒光傳感高且具有靈敏、高選擇的優(yōu)點(diǎn)。該MnO2調(diào)控的熒光開(kāi)關(guān)傳感原理被首次用于TPN的測(cè)定，這對(duì)TPN的分析檢測(cè)是一個(gè)有效的補(bǔ)充。