邊永軍 渠星宇＊, 李芬芳 張政委 李建晴 陳勇強 沈 珍

(1晉中學(xué)院化學(xué)化工系，晉中 030619)

(2南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，配位化學(xué)國家重點實驗室，南京 210023)

銅元素是一種非常重要的過渡金屬元素，已被廣泛應(yīng)用于制造業(yè)領(lǐng)域。在動、植物體內(nèi)，銅元素也起著非常重要的生理作用[1-2]。例如在人體內(nèi)，銅元素作為必需的痕量金屬元素，其含量僅次于鋅、鐵元素，缺失或過量都會使生理功能紊亂，導(dǎo)致各種疾病，像骨質(zhì)疏松癥、帕金森病及阿爾茨海默病等[3-8]。因此，定量地檢測銅離子具有重要的意義。

檢測銅離子的傳統(tǒng)方法主要有原子熒光光譜法[9]、原子吸收光譜法[10-11]和質(zhì)譜法[12-13]等，雖然這些方法都能較精確地檢測銅離子，但通常都需要昂貴的設(shè)備、煩瑣的樣品制備程序及較長的測試時間，這些缺陷極大地限制了這些方法在實際中特別是在活體或活細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用。熒光探針分析法由于具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好、短的響應(yīng)時間及無需昂貴的設(shè)備等優(yōu)點，近年來已引起了研究者的濃厚興趣，并應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括離子檢測[14-18]。

目前，研究較多的熒光探針按照熒光團來劃分主要有羅丹明類、稠環(huán)芳烴類、萘酰亞胺類、喹啉類及硼氟二吡咯(BODIPY)類[2,19-24]。其中BODIPY類熒光探針具有結(jié)構(gòu)易修飾、熒光量子產(chǎn)率高和摩爾吸光系數(shù)大等優(yōu)良的光物理性質(zhì)，是應(yīng)用最為廣泛的一類[25-26]。也有部分這類探針被應(yīng)用到銅離子檢測方面[27-36]。例如，2014年，Kursunlu等[29]合成了一個以2，6-二氨基-1，3，5-三嗪為識別基團的結(jié)構(gòu)對稱的BODIPY類熒光探針，該探針通過熒光猝滅和發(fā)射波長的藍移可以選擇性地識別Cu2+離子；2015年，He等[30]在BODIPY核的3、5位引入了3-吡啶乙炔基作為檢測基團，通過吸收峰的紅移也能選擇性地檢測Cu2+離子；2019年，Ecik等[31]將BODIPY核通過三氮唑連接到環(huán)四磷腈上組裝成一個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的熒光探針，在溶液中該探針能夠選擇性地識別Cu2+和Co2+離子。已報道的這些可以識別Cu2+離子的BODIPY類熒光探針，大多數(shù)具有合成困難或生物兼容性較差的缺點，限制了在實際中的應(yīng)用。我們設(shè)計、合成了一個新的BODIPY類熒光探針1，在BODIPY核的中位上引入了一個吡啶-2-甲?；R別基團。該探針制備簡單，并有好的溶解性和生物兼容性，在溶液中或活細(xì)胞內(nèi)能夠選擇性地檢測Cu2+離子，具有潛在的實際應(yīng)用價值。探針1的合成路線如Scheme 1所示。

Scheme 1 Synthesis route for probe 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所用儀器：TU-1901紫外光譜儀、Cary Eclips型熒光光譜儀、Bruker AV400核磁共振儀、Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜儀、蔡司LSM880共聚焦激光掃描顯微儀、ELX808酶標(biāo)儀、D8 Venture X射線單晶衍射儀、Vario MICRO cube元素分析儀等。

所用試劑均為分析純。吡啶-2-甲酸、對羥基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚等均購自百靈威試劑有限公司。干燥CH2Cl2在CaH2中回流并蒸餾得到，三乙胺在使用前需重蒸。配制Na+、K+、Ca2+、Hg2+、Cd2+、Ni2+、Fe3+、Al3+的溶液所用金屬鹽均為氯化物或水合物，Zn2+、Mg2+、Cu2+溶液用硫酸鹽水合物配制，Co2+溶液用醋酸鹽配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 吡啶-2-甲酰氯(3)的合成

化合物3參照文獻[37]合成：在100 mL圓底燒瓶中加入吡啶-2-甲酸(5 g，41 mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(0.5 mL)，在攪拌下，將氯化亞砜(15 mL)逐滴加入到上述混合物中，在室溫下繼續(xù)攪拌約2 h直到吡啶-2甲酸完全溶解。然后將剩余氯化亞砜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到的固體用冰乙醚洗滌數(shù)次，最后真空干燥得到化合物3，未經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.2 吡啶-2-甲酸(4-甲?；椒?酯(2)的合成[38]

在100 mL圓底燒瓶中加入對羥基苯甲醛(1.2 g，10 mmol)、3(1.6 g，11 mmol)和30 mL無水二氯甲烷，在攪拌下，將2.8 mL三乙胺逐滴地加入到上述混合物中，然后繼續(xù)在室溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，加入30 mL H2O猝滅，有機相用無水Na2SO4干燥。然后過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化(V石油醚/V二氯甲烷=4)，得白色固體1.6 g，產(chǎn) 率 70%。1H NMR(CDCl3，600 MHz)：δ10.04(s，1H)，8.77(d，J=6 Hz，1H)，8.30(d，J=6 Hz，1H)，7.99(d，J=6 Hz，2H)，7.98～7.95(m，1H)，7.62～7.60(m，1H)，7.47(d，J=12 Hz，2H)。

1.2.3 探針1的合成

在250 mL的圓底燒瓶中，依次加入2，4-二甲基吡咯(0.19 g，2.0 mmol)、2(0.23 g，1.0 mmol)和 100 mL干燥二氯甲烷，并用N2鼓泡置換1 min。然后在攪拌下快速滴加幾滴三氟乙酸(TFA)，整個體系用N2保護在室溫下避光反應(yīng)直至溶液變?yōu)樽霞t色。隨后向反應(yīng)體系中加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，0.23 g，1.0 mmol)繼續(xù)反應(yīng)1 h。最后再將3 mL三乙胺加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)20 min后接著加入3 mL三氟化硼乙醚溶液，反應(yīng)5 h后加水猝滅。用二氯甲烷萃取，干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，粗產(chǎn)物用硅膠柱層析純化(V石油醚/V二氯甲烷=2)，得紅色固體 67.67 mg，產(chǎn)率 15.2%。1H NMR(CDCl3，400 MHz)：δ8.87(d，J=4 Hz，1H)，8.30(d，J=4 Hz，1H)，7.95(t，J=4 Hz，1H)，7.59(t，J=4 Hz，1H)，7.42(d，J=8 Hz，2H)，7.36(d，J=8 Hz，2H)，6.00(s，2H)，2.59(s，6H)，1.45(s，6H)。13C NMR(CDCl3,100.518 MHz)：δ163.64，155.73，151.50，150.17，147.20，143.15，140.55，137.34，132.83，131.45,129.29,127.67，125.91，122.74，121.40，14.62，14.56。HRMS(ESI)：m/z[M+H]+按 C25H23BF2N3O2計算值：446.1846；實驗值：446.1844。元素分析按C25H22BF2N3O2計算值(%)：C 67.44，H 4.98，N 9.44；實驗值(%)：C 67.18，H 5.38，N 9.03。

1.2.4 單晶X射線衍射分析

探針1的單晶是在室溫下通過溶劑(正己烷/二氯甲烷)揮發(fā)法得到。單晶X射線衍射數(shù)據(jù)是在Bruker D8 Venture衍射儀上進行收集的，其中輻射源是石墨單色器MoKα，波長為0.071 073 nm，溫度為298 K。首先使用SMART軟件確定晶胞參數(shù)。使用程序SAINT進行數(shù)據(jù)的還原，SADABS程序進行吸收校正[39]。結(jié)構(gòu)通過SHELXS-2014采用直接法進行解析[40]，并對初始結(jié)構(gòu)使用全矩陣最小二乘法進行精修。對所有非氫原子進行各向開性處理后，對氫原子進行理論加氫，其中dC—H=0.093～0.096 nm，Uiso(H)=1.2Ueq(C)。主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)列在表1中。

表1 探針1分子的晶體數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)精修Table 1 Crystal data and structure refinement for probe 1

CCDC：2062769。

1.2.5 熒光量子產(chǎn)率的測試

探針1的熒光量子產(chǎn)率測試條件如下，選用羅丹明6G為標(biāo)準(zhǔn)，溶解到乙醇溶液中(ФF=0.88)，濃度為1 μmol·L-1，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5 nm，激發(fā)波長選用488 nm，熒光光譜的積分范圍為493～700 nm。熒光量子產(chǎn)率的計算公式：Yu=Ys(Fu/Fs)(As/Au)(Gu2/Gs2)。其中，Ys為羅丹明6G的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)u為探針1的熒光光譜積分面積，F(xiàn)s為羅丹明6G的熒光光譜積分面積，Au為探針1在488 nm處的吸光度，As為羅丹明6G在488 nm處的吸光度，Gu為探針1在不同溶液中的折射率，Gs為羅丹明6G在乙醇溶液中的折射率。

1.2.6 金屬離子的識別

將金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Hg2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Al3+)溶解到蒸餾水中，濃度為 0.1 mol·L-1，而 Cu2+溶解到蒸餾水中的濃度為0.005 mol·L-1。探針1溶解到DMSO和HAc-NaAc緩沖溶液(4∶1，V/V，pH=4.00)，濃度為 10 μmol·L-1。探針 1 對常見金屬離子選擇性實驗中，取用3 mL的探針1到比色皿中，依次分別加入 30 μL 0.005 mol·L-1的 Cu2+離子和 30 μL 0.1 mol·L-1的其它常見金屬離子，測定515 nm處的熒光強度。Cu2+識別實驗中，取3 mL的探針1到比色皿中，用微量進樣器不斷加入Cu2+溶液，測定515 nm處的熒光強度。

1.2.7 細(xì)胞成像實驗

RAW細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞所提供。RAW細(xì)胞在37℃和體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下，于DMEM培養(yǎng)基(12%胎牛血清和1%抗生素)中培養(yǎng)。RAW細(xì)胞貼在六孔板并孵育過夜，之后用PB(磷酸鹽緩沖溶液)(pH=6.00)溶液洗3次。探針1溶解到二甲亞砜(DMSO)溶液中并加入到RAW細(xì)胞中一起孵育 30 h。探針 1 在培養(yǎng)基中的濃度為 10 μmol·L-1，多余的探針1用PB溶液(pH=6.00)清洗3遍，用于細(xì)胞成像實驗。同時，取用1份相同條件下的RAW細(xì)胞，采用上述方法加入探針1，之后補加100 μmol·L-1的 CuSO4于培養(yǎng)基中孵育 1 h，PB(pH=6.00)溶液洗1次，用作細(xì)胞成像實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針1的晶體結(jié)構(gòu)

由單晶X射線衍射數(shù)據(jù)得到的晶體結(jié)構(gòu)橢球圖見圖1。該晶體屬于單斜晶系，晶體的空間群為P21/c。晶體主要的鍵長和鍵角見表S1(Supporting information)。探針1中的BODIPY基團的原子(N1、N2、B、C13、C14、C15、C17、C18、C20、C21、C23、C24)幾乎在一個平面，平均偏差為0.007 91 nm，F(xiàn)1和F2原子分別在該平面的上下兩側(cè)，與該平面的距離分別為0.099和0.127 nm。相連的苯基與該BODIPY平面形成的二面角為78.30°，同時苯基與吡啶環(huán)(C1、C2、C3、C4、C5、N3)形成的二面角為76.11°。

圖1 探針1的晶體結(jié)構(gòu):(a)30%概率水平橢球圖和(b)晶胞堆積圖Fig.1 Single crystal structure of probe 1:(a)displacement ellipsoids drawn at 30% ellipse probability level and(b)packing diagram

2.2 探針1的光譜學(xué)性質(zhì)

探針1具有較好的溶解性，能夠溶解到常見的有機溶劑中，但是不溶于水。探針1在二氯甲烷溶液中的紫外可見吸收光譜圖和熒光光譜圖如圖2a所示。探針1具有經(jīng)典的BODIPY類分子的吸收光譜和熒光光譜。探針1的最大吸收峰位于503 nm，肩峰位于475 nm，熒光峰位于511 nm。探針1的斯托克斯位移較小，為10 nm左右。探針1在不同溶劑中光譜性質(zhì)如表2所示，數(shù)據(jù)顯示探針1的最大吸收峰和熒光峰在不同極性的溶劑中變化很小。但是探針1的熒光量子產(chǎn)率在不同溶劑中顯示出明顯的規(guī)律，即隨著溶劑極性的增大而增大。探針1在DMSO溶液中的熒光量子產(chǎn)率較大，為0.79。

表2 探針1在不同溶劑中的光譜性質(zhì)Table 2 Spectroscopic properties of probe 1 in different solvents at 298 K

為研究溶液pH對探針1熒光強度的影響，將探針1溶解在DMSO與水的混合溶劑(VDMSO∶VH2O=4∶1)中，測試了探針1在不同pH值的溶液中515 nm處的熒光強度(圖2b)。實驗結(jié)果表明，探針1在弱酸性及酸性(pH=3～6)溶液中熒光強度變化不大，在強酸性(pH＞2)溶液中熒光強度下降；探針1在中性及弱堿性溶液中熒光強度下降，在堿性溶液中熒光猝滅。故在研究探針1對銅離子識別實驗中采用了DMSO和HAc-NaAc緩沖液的混合液(4∶1，V/V，pH=4.00)。

圖2 (a)探針1在二氯甲烷中的吸收光譜(黑線)和熒光光譜(綠線);(b)在DMSO/H2O混合溶劑(4∶1,V/V)中探針1(10 μmol·L-1)的熒光強度(515 nm)隨溶液pH變化的曲線Fig.2 (a)Absorption(black line)and fluorescence(green line)spectra of probe 1 in CH2Cl2;(b)Effect of pH on fluorescence intensity(515 nm)of probe 1(10 μmol·L-1)in DMSO/water mixed solvents(4∶1,V/V)

2.3 探針1對常見金屬離子識別

首先，我們測定了探針1與常見金屬離子的熒光響應(yīng)。將探針1溶解在DMSO/HAc-NaAc緩沖液(4∶1，V/V，pH=4.00)中，分別加入 1 mmol·L-1常見金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Hg2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Al3+)和50 μmol·L-1Cu2+，靜置2 min后測試溶液在515 nm處的熒光強度。熒光測試結(jié)果(圖3a)表明，Cu2+的加入使探針1在515 nm處的熒光強度下降了74%；加入20倍的其它常見金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Hg2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Al3+)，探針1在515 nm處的熒光強度均沒有明顯的變化。

其次，測定了探針1與Cu2+的反應(yīng)時間，如圖3b所示。實驗結(jié)果顯示，將探針1溶解到DMSO/HAc-NaAc緩沖液(4∶1，V/V，pH=4.00)中，其515 nm處的熒光強度不隨時間的增加而改變；在相同的條件下，在探針1溶液中加入50 μmol·L-1的Cu2+溶液，其515 nm處的熒光強度隨時間的增加發(fā)生明顯的下降，反應(yīng)2 min后，熒光強度保持不變。因此，探針1在DMSO/HAc-NaAc緩沖液(4∶1，V/V，pH=4.00)中能夠穩(wěn)定存在，同時探針1與Cu2+的反應(yīng)時間為2 min。因此探針1對Cu2+的檢測具有選擇性，可以作為熒光猝滅型的銅離子熒光探針。

圖3 (a)探針1在無金屬離子(blank)和加入1 mmol·L-1不同金屬離子或50 μmol·L-1Cu2+后515 nm處的熒光強度;(b)探針1加入Cu2+(50 μmol·L-1)后515 nm處熒光強度隨反應(yīng)時間變化的曲線Fig.3 (a)Fluorescence intensity of probe 1 before(blank)and after addition of 1 mmol·L-1 different metal ions or 50 μmol·L-1Cu2+;(b)Time-dependent fluorescence intensity of probe 1 at 515 nm upon treatment with Cu2+(50 μmol·L-1)

2.4 探針1對溶液中的銅離子的識別

我們測試了不同的Cu2+加入量對探針1的熒光光譜的影響，結(jié)果如圖4a所示。熒光光譜圖表明，隨著Cu2+加入量的增大，探針1在515 nm處的熒光強度下降。當(dāng)加入35倍的Cu2+時，515 nm處的熒光強度降為最低。測試了探針1與Cu2+反應(yīng)后的熒光強度與Cu2+濃度的關(guān)系。如圖4b所示，縱坐標(biāo)采用如下公式歸一化：R=1-Ii/Imax，其中Ii為探針1與Cu2+反應(yīng)后的熒光強度，Imax為探針1未與Cu2+反應(yīng)前的熒光強度。通過線性擬合得到溶液熒光強度和Cu2+濃度的關(guān)系為y=0.024 38x-0.107 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.982 6，并且計算出探針1檢測Cu2+的最低檢出限為0.15 μmol·L-1。因此探針1可以在溶液中檢測Cu2+的存在，確實是熒光猝滅型的銅離子熒光探針。

圖4 (a)加入不同濃度的Cu2+后探針1的熒光光譜變化;(b)探針1在515 nm處歸一化的熒光強度隨Cu2+濃度變化的曲線Fig.4 (a)Fluorescence spectra of probe 1 upon addition of Cu2+ with different concentrations(Inset:Dependence of response signal on concentration of Cu2+ ions);(b)Curve of normalized fluorescence intensity at 515 nm of probe 1 with change of Cu2+ concentration

2.5 探針1對Cu2+的識別機理研究

由相關(guān)文獻[23,38,41-42]推斷，探針1識別銅離子的機理如圖5所示。探針1結(jié)構(gòu)中的酯基在Cu2+的作用下發(fā)生水解形成化合物4，化合物4能夠發(fā)生分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)，具有弱熒光。為了進一步驗證這一機理，我們分別對探針1在加入Cu2+前后進行了HRMS質(zhì)譜測定。如圖S3和S4所示，探針1(C25H23BF2N3O2[M+H]+m/z計算值：446.184 6，實驗值：446.184 4)加入 Cu2+后出現(xiàn)新峰(m/z=341.162 3)，該峰可歸屬于化合物4(C19H20BF2N2O[M+H]+m/z=341.163 1)。由此可以推斷，探針1與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)物是中位為4-羥基苯基的BODIPY分子4，能夠發(fā)生PET，導(dǎo)致分子具有弱熒光。

圖5 探針1對Cu2+可能的識別機理Fig.5 Proposed mechanism of probe 1 to Cu2+

2.6 探針1檢測細(xì)胞中Cu2+

為了評價探針1檢測生物細(xì)胞中銅離子的性能，首先進行了探針1的細(xì)胞毒性實驗。具體實驗內(nèi)容為將濃度為0～100 μmol·L-1的探針1分別孵育到RAW細(xì)胞中5和10 h，檢測RAW細(xì)胞的存活率，如圖6所示。實驗結(jié)果表明，孵育5 h，100 μmol·L-1的探針1在RAW細(xì)胞中存活率高于90%；孵育10 h，80 μmol·L-1的探針1在RAW細(xì)胞中存活率高于80%。因此探針1能夠用于生物細(xì)胞成像實驗。

之后，我們測試了探針1對細(xì)胞中Cu2+的成像。具體實驗內(nèi)容為在37 ℃下，將10 μmol·L-1探針1在RAW細(xì)胞中孵育30 min；另取一份探針1在相同的條件下補加 100 μmol·L-1的 Cu2+，孵育 1 h，分別用485 nm的光激發(fā)。結(jié)果表明探針1在RAW細(xì)胞中顯示綠色的熒光(圖 7a、7c)，加入 Cu2+后探針 1 在RAW細(xì)胞中的熒光猝滅如圖7d、7f所示。另外我們還檢測了探針1在細(xì)胞中的著色位置。實驗結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色強度比值較大(I2/I1＞20，圖S5)，表明探針1主要著色到RAW細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。因此，探針1具有較好的細(xì)胞活性，主要著色到細(xì)胞質(zhì)，能夠高效檢測細(xì)胞中銅離子的存在。

圖6 探針1的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果Fig.6 Cytotoxicity test results of probe 1

圖7 探針1在RAW細(xì)胞中共聚焦熒光成像圖片、明場下圖片及交疊圖片:(a)探針1在RAW細(xì)胞中孵育30 min的圖片;(b)RAW細(xì)胞在(a)明場下的圖片;(c)RAW細(xì)胞在(a)、(b)交疊下的圖片;(d)RAW細(xì)胞中補加100 μmol·L-1的Cu2+孵育1 h的圖片;(e)RAW細(xì)胞在(d)明場下的圖片;(f)RAW細(xì)胞在(d)、(e)交疊下的圖片F(xiàn)ig.7 Confocal fluorescence imaging image,brightfield image and overlap image of probe 1 in RAW cells:(a)cells incubated with probe 1 for 30 min;(b)bright field image of cells showed in(a);(c)one overlay image of(a),(b);(d)cells incubated with probe 1 for 30 min and then supplemented with 100 μmol·L-1 of Cu2+;(e)bright field image of cells showed in(d);(f)one overlay image of(d),(e)

3 結(jié)論

在BODIPY母核的中位引入功能基團吡啶-2-羧酸苯酚酯基，得到了熒光探針1。采用核磁、質(zhì)譜、單晶X射線衍射表征了探針1的分子結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)。探針1具有較大的摩爾吸光系數(shù)和高熒光量子產(chǎn)率(0.79)。PET原理可以解釋銅離子與探針1作用導(dǎo)致熒光猝滅，故探針1能夠作為一種熒光猝滅型的Cu2+熒光探針。探針1具有較好的生物活性，易著色到細(xì)胞質(zhì)，可用于外源性銅離子的成像檢測。

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