劉婷婷 宋巧鳳 王希柱 閆玉敏 劉小雪

冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等血管再通術(shù)治療缺血性心臟病時(shí)易造成心肌缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷。心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡等可加重H/R損傷[1-4]。氯吡格雷屬于抑制血小板聚集的噻吡啶類(lèi)衍生物，可用于缺血性疾病的治療[5]，但對(duì)心肌H/R損傷的治療效果及可能機(jī)制尚不明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-4231(lncRNA-4231)表達(dá)上調(diào)可保護(hù)心肌細(xì)胞[6]。本研究建立心肌細(xì)胞H/R損傷模型，探討氯吡格雷對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響及其對(duì)lncRNA-4231的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯吡格雷購(gòu)自樂(lè)普藥業(yè)股份有限公司；大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；甲基噻唑基四唑(MTT)、Annexin V-FITC/PI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；pcDNA3.1購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板(5×103/孔)，分別加入不同濃度(H/R組0、低劑量藥物組12.5 μg/mL、中劑量藥物組25 μg/mL、高劑量藥物組50 μg/mL)的氯吡格雷處理24 h，將H9c2細(xì)胞置于缺氧裝置(95%N2、5%CO2)中處理24 h，轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)箱(95%O2、5%CO2)內(nèi)復(fù)氧處理6 h，進(jìn)行H/R處理[7]。將正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞作為對(duì)照組。

分別將pcDNA、pcDNA-lncRNA-4231轉(zhuǎn)染至H9c2心肌細(xì)胞，隨后進(jìn)行上述H/R處理，分別記作pcDNA組、pcDNA-lncRNA-4231組。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集各組心肌細(xì)胞接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，孵育5 min，檢測(cè)各孔吸光度值(OD值)。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集各組心肌細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS洗滌，參照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 檢測(cè)MDA、SOD的水平

收集各組心肌細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4 ℃條件下3 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min，吸取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA水平及SOD的活性。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-4231的表達(dá)水平

收集各組心肌細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，檢測(cè)RNA濃度，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，Real-time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA-4231的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 Western blot檢測(cè)活化胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表達(dá)水平

RIPA裂解液提取各組心肌細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入一抗稀釋液與二抗稀釋液，滴加ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯吡格雷對(duì)H/R后心肌細(xì)胞活性及凋亡的影響

與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05)；與H/R組比較，中劑量藥物組、高劑量藥物組細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P均<0.05)；低劑量藥物組與中劑量藥物組、中劑量藥物組與高劑量藥物組各指標(biāo)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2、表1。

表1 氯吡格雷處理后各組心肌細(xì)胞存活率、凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

圖1 氯吡格雷對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響

圖2 氯吡格雷對(duì)心肌細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 氯吡格雷對(duì)H/R后心肌細(xì)胞中MDA、SOD的影響

與對(duì)照組比較，H/R組MDA的水平顯著升高，SOD的活性顯著降低(P均<0.05)；與H/R組比較，中劑量藥物組、高劑量藥物組MDA的水平顯著降低，SOD的活性顯著升高(P均<0.05)；低劑量藥物組與中劑量藥物組、中劑量藥物組與高劑量藥物組MDA、SOD的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 氯吡格雷處理后各組心肌細(xì)胞MDA、SOD水平比較

2.3 氯吡格雷對(duì)H/R后心肌細(xì)胞lncRNA-4231表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，H/R組lncRNA-4231的表達(dá)水平顯著降低(0.21±0.01對(duì)0.96±0.05，P<0.05)；與H/R組比較，中劑量藥物組(0.50±0.03)、高劑量藥物組(0.83±0.04)lncRNA-4231的表達(dá)水平均顯著升高(P均<0.05)，且高劑量藥物組顯著高于中劑量藥物組(P<0.05)。

2.4 lncRNA-4231對(duì)H/R后心肌細(xì)胞活性及凋亡的影響

與pcDNA組比較，pcDNA-lncRNA-4231組細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P均<0.05)，見(jiàn)圖3、圖4、表3。

表3 過(guò)表達(dá)lncRNA-4231后兩組心肌細(xì)胞活性及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

圖3 lncRNA-4231對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響

圖4 lncRNA-4231對(duì)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 lncRNA-4231對(duì)H/R后心肌細(xì)胞中MDA、SOD的影響

與pcDNA組比較，pcDNA-lncRNA-4231組MDA水平顯著降低[(44.82±1.10) μmol/L對(duì)(79.89±1.64) μmol/L，P<0.05]，SOD活性顯著升高[(58.94±1.50) U/mL對(duì)(26.62±1.76) U/mL，P<0.05]。

3 討論

心肌細(xì)胞H/R損傷可導(dǎo)致心力衰竭等疾病的發(fā)生，減輕心肌細(xì)胞H/R損傷是血管再通治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究顯示，五味子乙素等藥物可能通過(guò)靶向調(diào)控某一基因的表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[8-10]。

氯吡格雷可降低機(jī)體炎性反應(yīng)，改善急性心肌梗死患者臨床癥狀及體征[11]，可通過(guò)改善急性冠脈綜合征患者血管內(nèi)皮功能減緩疾病發(fā)展[12]，還可改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病合并腦梗死患者神經(jīng)功能及凝血功能[13]。本研究探討氯吡格雷對(duì)H/R損傷后心肌細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示，H/R處理后心肌細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率及cleaved caspase-3表達(dá)水平顯著升高，而不同濃度的氯吡格雷處理后細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3表達(dá)水平均顯著降低。caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)時(shí)，caspase-3被激活形成cleaved caspase-3，促使細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果提示氯吡格雷可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。MDA屬于過(guò)氧化物酶，其水平升高預(yù)示心肌細(xì)胞損傷加重，而SOD屬于抗氧化酶，可通過(guò)清除氧自由基增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力[15]。本研究結(jié)果顯示H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MDA水平顯著升高，SOD活性顯著降低，而氯吡格雷處理后MDA水平顯著降低，SOD活性顯著升高，且呈劑量依賴(lài)性，提示硫酸氫氯吡格雷可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

研究表明，抑制或促進(jìn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)表達(dá)可減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[16-17]，提示lncRNA在心肌H/R損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-4231的表達(dá)水平顯著降低，而氯吡格雷處理后lncRNA-4231的表達(dá)水平顯著升高，且呈劑量依賴(lài)性，提示氯吡格雷可能通過(guò)促進(jìn)lncRNA-4231表達(dá)減輕心肌細(xì)胞H/R損傷。本研究進(jìn)一步分析顯示，lncRNA-4231過(guò)表達(dá)后H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3表達(dá)水平顯著降低，且MDA水平顯著降低，SOD活性顯著升高，提示硫酸氫氯吡格雷可能通過(guò)促進(jìn)lncRNA-4231表達(dá)，促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

綜上所述，氯吡格雷可能通過(guò)上調(diào)lncRNA-4231的表達(dá)保護(hù)H/R后的心肌細(xì)胞，但lncRNA-4231的下游作用靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步探究。