胡菱 孟林鳳 胥亞楠 裴赫男 王茜 胡華剛 趙冬琰 劉梅潔

充血性心力衰竭(CHF)是多種心血管疾病進(jìn)展的終末階段，約50%的患者死于惡性心律失常[1]，而惡性心律失常發(fā)生的主要機(jī)制是心肌細(xì)胞電重構(gòu)。心肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)是心肌細(xì)胞電重構(gòu)的重要基礎(chǔ)。多項(xiàng)研究表明，適量有氧運(yùn)動(AE)能夠顯著改善心血管內(nèi)皮功能，提高受試者運(yùn)動耐力，降低交感神經(jīng)興奮性，抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的活動，從而顯著改善心肌缺血及缺氧狀況[2-7]。但AE對心室肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)的作用尚未明確。延遲整流鉀電流(IK)是心室肌細(xì)胞復(fù)極的主要電流之一，本研究建立CHF大鼠模型，通過AE干預(yù)，觀察快速激活延遲整流鉀電流(IKr)編碼基因KCNH2及及慢激活延遲整流鉀電流(IKs)α亞基編碼基因KCNQ1的表達(dá)水平，探討AE在CHF治療中的作用及病理生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料

1.2 CHF模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、CHF組、假手術(shù)+AE組和CHF+AE組，每組12只。SD大鼠禁食12 h，稱量體質(zhì)量，腹部脫毛后采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g) 腹腔注射麻醉大鼠，CHF模型建立參照參考文獻(xiàn)[8]。將大鼠仰臥固定，消毒后沿劍突自腹中線略偏左側(cè)垂直切開腹部皮膚，鈍性分離腹主動脈及左腎動脈。用4號手術(shù)縫線于左腎動脈上方約1.0 cm處結(jié)扎腹主動脈，使腹主動脈狹窄約80%[腹主動脈直徑約(1.76±0.10) mm]，逐層縫合。假手術(shù)組于腹主動脈下放置手術(shù)縫線但不結(jié)扎，CHF組結(jié)扎腹主動脈，兩組大鼠手術(shù)1周后，先進(jìn)行適應(yīng)性游泳1周，再進(jìn)行一般照護(hù)8周。假手術(shù)+AE組及CHF+AE組采取無負(fù)重游泳訓(xùn)練，在120 cm×80 cm×70 cm的長方形塑料水桶中進(jìn)行，水桶四壁光滑，水深約40 cm，水溫(32.0±2.5)℃，每天游泳運(yùn)動1次，每次20 min，兩組大鼠手術(shù)1周后，先進(jìn)行適應(yīng)性游泳1周，再進(jìn)行AE訓(xùn)練8周。

1.3 心功能指標(biāo)測定

各組飼養(yǎng)及訓(xùn)練結(jié)束后，采用VisualSonics 770超聲，17.5 MHz探頭測定SD大鼠的左室后壁厚度(LVPWD)及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。取大鼠內(nèi)眥靜脈血冰上靜置2 h，3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min，取上清液，用ELISA試劑盒測定血漿中NT-proBNP含量。使用過量10%水合氯醛將大鼠處死，摘取心臟，分離心房，剪去右心室游離壁，稱量左室質(zhì)量，左室質(zhì)量指數(shù)(LVWI)=左室質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。

1.4 HE染色及天狼星紅染色檢測心室肌組織形態(tài)及纖維化程度

將心室肌組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測KCNQ1和KCNH2的mRNA表達(dá)水平

使用Trizol Reagent提取各組心室肌細(xì)胞總RNA。大鼠KCNQ1上游引物為5′-CGCCTCCTG TTTCTCTGTCT-3′，下游引物為5′-CGTCTTCGTCTCCGTCTTTG-3′。大鼠KCNH2上游引物為5′-ACCCACAATGTCACCGAGAAG-3′，下游引物為5′-CCCTGACCGAGTAAGACGAC-3′。GAPDH上游引物為5′-GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3′，下游引物為5′-TAGTGACGGTGGGTCTTCTGA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt計(jì)算KCNQ1和KCNH2 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.6 Western Blot檢測KCNQ1和KCNH2的蛋白表達(dá)水平

提取各組心室肌細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。取60 μg總蛋白上樣，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入KCNH2、KCNQ1一抗，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。充分漂洗后顯影、攝片并進(jìn)行條帶灰度定量測定。以GAPDH作為內(nèi)參，利用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用Graphpad Prism 6軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較

與假手術(shù)組相比，CHF組的LVEF顯著降低，LVPWD、LVWI及NT-proBNP水平均明顯升高(P均<0.01)；假手術(shù)+AE組與假手術(shù)組的心功能指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CHF組相比，CHF+AE組LVEF明顯升高，LVPWD、LVWI及NT-proBNP水平均明顯降低(P均<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠LVEF、LVPWD、LVWI、NT-proBNP檢測結(jié)果比較

2.2 各組心室肌組織形態(tài)學(xué)及纖維化程度比較

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組、假手術(shù)+AE組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；CHF組可見心肌細(xì)胞明顯肥大、水腫，部分心肌細(xì)胞呈脂肪樣變性，出現(xiàn)間質(zhì)充血及纖維排列紊亂，CHF+AE組的上述情況較CHF組減輕。見圖1。

天狼星紅染色可顯示心肌間質(zhì)及血管周圍膠原分布情況。假手術(shù)組、假手術(shù)+AE組成纖維細(xì)胞未見明顯增殖，細(xì)胞排列整齊；CHF組成纖維細(xì)胞增殖，膠原累積，Ⅲ型膠原增多，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，CHF+AE組的上述表現(xiàn)較CHF組明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)及纖維化程度

2.3 各組心室肌細(xì)胞KCNH2 和KCNQ1表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組相比，CHF組KCNQ1和KCNH2的mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P均<0.05)；假手術(shù)+AE組與假手術(shù)組KCNQ1和KCNH2 mRNA表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CHF組相比，CHF+AE組KCNQ1及KCNH2的mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P均<0.05)。見表2。

與假手術(shù)組相比，CHF組心室肌細(xì)胞KCNQ1及KCNH2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P均<0.05)；假手術(shù)+AE組與假手術(shù)組心室肌細(xì)胞KCNQ1及KCNH2蛋白表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CHF組相比，CHF+AE組KCNQ1及KCNH2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P均<0.05)。見圖2、表2。

表2 各組KCNH2和KCNQ1的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組KCNQ1及KCNH2蛋白表達(dá)情況

3 討論

心室重構(gòu)包括結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電重構(gòu)，是CHF的重要病理生理機(jī)制[9]。RAAS是導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要因素。NT-proBNP能對抗RAAS引起的水鈉潴留，可擴(kuò)張血管，增加排鈉，有較好的穩(wěn)定性，是評價(jià)CHF的敏感性及特異性指標(biāo)。研究證實(shí)，AE可以改善CHF患者的心肺耐力，降低 NT-proBNP水平，改善患者的心功能[10]。本研究成功建立了CHF大鼠模型，發(fā)現(xiàn)接受AE的CHF大鼠的LVEF較未接受AE的CHF大鼠升高，LVWI、NT-proBNP水平降低，表明AE可改善心室射血功能，抑制CHF所致心室重構(gòu)，同時(shí)能夠?qū)筊AAS引起的水鈉潴留，降低NT-proBNP水平。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，接受AE的CHF大鼠心肌細(xì)胞水腫、增大、脂肪變性、間質(zhì)充血等病理改變較未接受AE的CHF大鼠有所減輕，表明AE對CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡有改善作用。這與文獻(xiàn)報(bào)道AE能顯著改善CHF大鼠的心功能、減輕心肌纖維化一致[2]。

IK具有外向整流的特點(diǎn)，包括3種亞型，分別為超快激活電流(IKur)、IKr和IKs，大鼠心室肌細(xì)胞僅有后2種電流，其改變可導(dǎo)致功能衰竭的心室肌細(xì)胞發(fā)生快速室性心律失常。研究表明，在CHF大鼠發(fā)生室性心律失常時(shí)，存在IK及IKs減小，動作電位持續(xù)時(shí)間(APD)顯著延長[11-13]。本研究檢測大鼠心室肌IKr及IKs-α亞基的編碼基因KCNH2和KCNQ1，發(fā)現(xiàn)CHF大鼠KCNH2和KCNQ1的mRNA表達(dá)水平明顯上升，接受AE后，KCNH2和KCNQ1的mRNA表達(dá)水平明顯下降，而CHF大鼠KCNQ1及KCNH2的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)錄和翻譯是兩個(gè)不同的過程，在某些特定的條件下可以脫節(jié)，翻譯過程中，mRNA可能會受到其他因子的負(fù)調(diào)控。這與文獻(xiàn)報(bào)道CHF大鼠在發(fā)生室性心律失常時(shí)KCNH2和KCNQ1蛋白表達(dá)受抑制結(jié)果一致[14]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，AE參與調(diào)控CHF大鼠心肌結(jié)構(gòu)與IKr、IKs離子通道重構(gòu)，AE可改善心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，逆轉(zhuǎn)心肌電重構(gòu)中IK離子通道的改變。該研究為臨床運(yùn)用AE治療CHF、改善CHF預(yù)后提供一定理論基礎(chǔ)。