韓玉澤 張春雨 梁慧 趙丹

心血管疾病是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥。心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)占心臟細(xì)胞總數(shù)的1/3，在維持冠狀動(dòng)脈微血管和鄰近心肌細(xì)胞正常功能方面起著關(guān)鍵作用[1]。然而，慢性高血糖等因素可引起CMEC功能障礙和凋亡，導(dǎo)致微血管病變[2]。羅格列酮是噻唑烷二酮類抗糖尿病藥，可通過提高胰島素的敏感性有效控制血糖。研究顯示，羅格列酮可減輕CMEC損傷并改善其功能，對改善糖尿病心肌微血管病變具有重要意義[3-4]。在正常狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力有限，但在病理情況下內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移對血管修復(fù)具有始動(dòng)作用[5]。然而，羅格列酮能否促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖并提高其遷移能力尚未可知。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)是研究最為廣泛的去乙酰化酶同源物，研究顯示CMEC細(xì)胞Sirt1活性降低，可抑制細(xì)胞自噬，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)糖尿病冠狀動(dòng)脈微血管功能障礙的發(fā)生[6]。但目前尚不明確羅格列酮是否通過調(diào)控Sirt1表達(dá)影響CMEC增殖和遷移。本研究探討羅格列酮對高糖處理的大鼠CMEC增殖和遷移的影響，并分析其對Sirt1表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞CMEC購于德國微生物菌種保藏中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液購于美國Gibco公司；羅格列酮(純度為93.3%，批號(hào)100673-201902)購于中國食品藥品檢定研究院；Sirt1小干擾RNA(si-Sirt1)及其對照(si-NC)、PCR引物由上海生工公司提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)購于美國Sigma公司；Transwell小室購于美國BD公司；兔源抗Sirt1抗體、兔源抗P21抗體、兔源抗上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)抗體、山羊抗兔IgG二抗購于美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

CMEC細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代，同步化以后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。以含5.5 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組；含33 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為高糖對照組[7]；在含33 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基中加入終濃度為5、10、20 μmol/L的羅格列酮，培養(yǎng)的細(xì)胞分別作為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組[8]。培養(yǎng)24 h后，檢測細(xì)胞增殖、遷移能力以及Sirt1的表達(dá)水平。

將si-NC、si-Sirt1分別轉(zhuǎn)染CMEC，并采用33 mmol/L葡萄糖和20 μmol/L羅格列酮處理24 h，記為實(shí)驗(yàn)3+si-NC組、實(shí)驗(yàn)3+si-Sirt1組，隨后檢測細(xì)胞增殖和遷移能力變化。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力

將各組CMEC細(xì)胞按照5×103/孔接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK8試劑10 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測450 nm波長各孔光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

采用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸各組CMEC細(xì)胞，在Transwel上室加入1×105個(gè)CMEC細(xì)胞，在24孔板下室加入含10 ng/mL血管內(nèi)皮生長因子的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育8 h后，用棉簽擦去上室未遷移細(xì)胞，經(jīng)多聚甲醛戈丁和結(jié)晶紫染色后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞過膜情況，選取3個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)，以均值表示細(xì)胞遷移能力。

1.5 Western blot檢測P21、E-cadherin和Sirt1的蛋白表達(dá)水平

采用RIPA裂解緩沖液提取各組CMEC細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶室溫封閉膜1 h，洗膜后，4 ℃條件下用稀釋的一抗溶液孵育膜過夜，加入稀釋的二抗溶液室溫孵育膜1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，ImageJ軟件分析目的蛋白的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Sirt1的mRNA表達(dá)水平

采用Trizol試劑從各組細(xì)胞分離總RNA，利用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green Master Mix在ABI 7900HT系統(tǒng)上檢測Sirt1的mRNA表達(dá)水平。Sirt1引物序列：上游5′-GCCAGAGTCCAAGTTTAGAAGA-3′，下游5′-CCATCAGTCCCAAATCCAG-3′。GAPDH引物序列：上游5′-TGGAAGGACTCATGACCACA-3′，下游5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法分析Sirt1的mRNA表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)并重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對高糖處理的CMEC增殖的影響

與對照組比較，高糖對照組CMEC存活率明顯降低；與高糖對照組比較，高糖聯(lián)合羅格列酮處理后CMEC存活率均明顯升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組CMEC存活率比較

2.2 羅格列酮對高糖處理的CMEC遷移的影響

與對照組比較，高糖對照組CMEC遷移數(shù)量顯著降低；與高糖對照組比較，高糖聯(lián)合羅格列酮處理后CMEC遷移數(shù)量均顯著增加(P均<0.05)。見表2。

表2 各組CMEC遷移數(shù)量比較

2.3 羅格列酮對高糖處理的CMEC中Sirt1、P21、E-cadherin表達(dá)的影響

與對照組比較，高糖對照組CMEC中Sirt1的 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，P21和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平均顯著增加；與高糖對照組比較，高糖聯(lián)合羅格列酮處理后CMEC中Sirt1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，P21和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P均<0.05)。見表3和圖1。

表3 各組CMEC中Sirt1、P21、E-cadherin的表達(dá)水平比較

圖1 各組CMEC中Sirt1、P21、E-cadherin的蛋白表達(dá)情況

2.4 抑制Sirt1能減輕羅格列酮對高糖處理的CMEC增殖、遷移的影響

與實(shí)驗(yàn)3+si-NC組比較，實(shí)驗(yàn)3+si-Sirt1組CMEC存活率顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 2組轉(zhuǎn)染后CMEC存活率比較

與實(shí)驗(yàn)3+si-NC組比較，實(shí)驗(yàn)3+si-Sirt1組CMEC中Sirt1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin和P21的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，細(xì)胞遷移數(shù)量顯著降低(P均<0.05)。見表5和圖2。

表5 2組轉(zhuǎn)染后CMEC遷移數(shù)量及蛋白表達(dá)水平比較

圖2 2組轉(zhuǎn)染后Sirt1、P21和E-cadherin的蛋白表達(dá)情況

3 討論

羅格列酮為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的特異、高效激動(dòng)劑。羅格列酮除通過激活PPARγ受體對糖尿病有治療作用外，對心血管系統(tǒng)也有不同程度的保護(hù)作用。高夏青等[9]發(fā)現(xiàn)羅格列酮通過提高血清超氧化物歧化酶水平，抑制炎性因子分泌，減輕心肌氧化應(yīng)激和炎性損傷，減少心肌梗死面積。鄒曉譯等[10]發(fā)現(xiàn)羅格列酮通過降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性和血管超氧陰離子水平，減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血壓升高和心肌肥厚。郝拮等[11]發(fā)現(xiàn)羅格列酮可通過促進(jìn)脂聯(lián)素分泌，減少梗死面積，進(jìn)而在缺血預(yù)適應(yīng)中發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究探討羅格列酮對高糖處理的CMEC增殖和遷移的影響，發(fā)現(xiàn)高糖處理的CMEC的存活率和遷移能力顯著降低，而羅格列酮干預(yù)可使高糖處理的CMEC的存活率和遷移能力顯著升高。P21是一種重要的周期蛋白激酶抑制劑，可將細(xì)胞周期阻滯于G1期，具有抗細(xì)胞增殖作用[12]。E-cadherin是細(xì)胞黏附分子，可維持上皮極性和完整性，其表達(dá)或功能缺失與細(xì)胞遷移密切相關(guān)[13]。高糖處理的CMEC的P21和E-cadherin蛋白表達(dá)升高，而羅格列酮干預(yù)后P21和E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低，與上述功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以上研究表明羅格列酮可拮抗高糖對CMEC增殖和遷移的抑制作用，對高糖處理的CMEC細(xì)胞有保護(hù)作用。

研究顯示，通過去乙酰化作用，Sirt1不僅在細(xì)胞代謝、分化、凋亡、氧化應(yīng)激以及衰老中發(fā)揮調(diào)控作用，還參與心臟發(fā)育、心肌細(xì)胞生長、血管形成，是心血管疾病防治的潛在靶點(diǎn)[14]。Zhong等[15]發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可通過激活Sirt1維持線粒體電位，減少線粒體膜通道孔開放，抑制促凋亡因子釋放，促進(jìn)CMEC細(xì)胞存活，保護(hù)微血管結(jié)構(gòu)和功能。此外，Sirt1還可降低高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，拮抗高糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖處理的CMEC的Sirt1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，羅格列酮可拮抗高糖對Sirt1表達(dá)的抑制作用，提示羅格列酮可能通過調(diào)控Sirt1表達(dá)參與對CMEC增殖、遷移的調(diào)控。進(jìn)一步研究顯示，抑制Sirt1可減輕羅格列酮對高糖處理的CMEC增殖和遷移的影響，這說明上調(diào)Sirt1是羅格列酮拮抗高糖對CMEC細(xì)胞增殖和遷移抑制作用的重要機(jī)制。

總之，本研究證實(shí)羅格列酮通過上調(diào)Sirt1可促進(jìn)高糖處理的CMEC增殖、遷移能力，為臨床應(yīng)用羅格列酮改善糖尿病患者心肌微血管損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。