張?jiān)讫?，王慧真，?震，劉保衛(wèi)，鄭素月**

（1.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021；3.黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000）

梭倫剝管孔菌（Piptoporus soloniensis） 為世界性分布，屬于非褶菌目（Polyporales） 多孔菌科（Polyporaceae） 剝管孔菌屬 （Piptoporus）。剝管孔菌屬由Karsten在1881年建立，包括3個種，分別為樺剝管孔菌 [Piptoporus betulinus(Bull.)P.Karst]、櫟剝管孔菌 [Piptoporus quercinus(Schrad.)Pilát] 和梭倫剝管孔菌 [P.soloniensis(Dubois)Pilát][1－3]，其模式種為樺剝管孔菌（P.betulinus）[4]。梭倫剝管孔菌與硫磺菌（Laetiporus sulphureus） 子實(shí)體在某些特征上有些相似，故從形態(tài)上經(jīng)常被誤認(rèn)為硫磺菌，1983年Lombard將梭倫剝管孔菌與硫磺菌從菌絲和孢子特征方面進(jìn)行了區(qū)分[5]。研究發(fā)現(xiàn)，梭倫剝管孔菌在液體培養(yǎng)中產(chǎn)生熱帶水果的香味，通過氣相色譜－質(zhì)譜分析法分別鑒定出其主要和次要化合物為γ－癸內(nèi)酯和γ－辛醇內(nèi)酯，而γ－癸內(nèi)酯可以作為食品香料、日用化妝品香精以及飼料香味劑等[6]。梭倫剝管孔菌中分離制備的肽酶（PsoP1）可作為凝乳酶的替代品，在醫(yī)學(xué)上具有較大的開發(fā)價值[7]。

在野生食用菌的資源開發(fā)、保護(hù)、利用方面，野生食用菌的分離鑒定是一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子ITS鑒定，對野生食用菌進(jìn)行分類、開發(fā)等基礎(chǔ)工作，為完善大型真菌的種屬分類提供依據(jù)。關(guān)于梭倫剝管孔菌的研究，目前未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)相關(guān)報道。通過對采集野生梭倫剝管孔菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定，培養(yǎng)測定該菌株菌絲體的生長發(fā)育條件，以期為該菌株的馴化、食（藥）用價值研究、商用價值開發(fā)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生子實(shí)體采集于河南省南陽市南召縣馬市坪鄉(xiāng)南坪村 （東經(jīng) 115°55′，北緯 33°12′，海拔 933 m）。采集時間為2018年7月29日，子實(shí)體長于山中漆樹上，由河北工程大學(xué)食用菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離、鑒定和保藏，菌株編號為NZ25。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

對子實(shí)體的形態(tài)、大小、顏色、氣味、菌柄的長短、菌環(huán)的有無等進(jìn)行觀察鑒定；采用組織分離法獲得純培養(yǎng)菌絲體，菌絲體形態(tài)采用插片觀察法[8]。

1.2.2 ITS鑒定

DNA試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取菌絲體DNA，利用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATTGATATGC-3’） 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行克隆測序。將得到的菌株ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，利用Clustal_X軟件對所得序列進(jìn)行校正和比對分析，選取相近屬不同種的ITS序列，采用MEGA 6.0軟件，以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 最適溫度

打孔器取菌齡一致菌餅，接種于PDA綜合培養(yǎng)基平板中央，接種后平板分別置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃恒溫箱中培養(yǎng)，用十字劃線法測量菌落直徑，每個處理3次重復(fù)。

1.2.4 最適pH

分別設(shè)置pH梯度為5、6、7、8、9，共5個處理，每個處理3次重復(fù)。

1.2.5 最適碳源

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別用不同的碳源代替葡萄糖，供試碳源有麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉，以不添加葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基做空白對照，每個處理3次重復(fù)。

1.2.6 最適氮源

供試氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨，添加量均為2 g·L-1，以不添加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基做空白對照，每個處理3次重復(fù)。

1.2.7 最適無機(jī)鹽

供試無機(jī)鹽有磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化鈉、硫酸鎂，添加量均為2 g·L-1，以不添加無機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基做空白對照，每個處理3次重復(fù)。

1.2.8 最適生長因子

供試生長因子有VB1、VC、VE，添加量均為2片/L，空白對照中不添加生長因子，每個處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與分析

菌株NZ25的子實(shí)體和菌絲體形態(tài)（顯微鏡倍數(shù)為10×40倍），見圖1。

圖1 NZ25菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain NZ25

如圖1所示，菌株NZ25的子實(shí)體菌蓋不規(guī)則、半圓形，表面白色至淺橙色或淺褐色；子實(shí)體層不規(guī)則，無環(huán)帶，菌肉白色至黃色；菌落圓整，菌絲淡黃色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，有濃郁的皂香味；顯微觀察可見生殖菌絲具有明顯的鎖狀聯(lián)合。

2.2 ITS鑒定和分析

經(jīng)ITS-PCR擴(kuò)增測序，獲得NZ25菌株的ITS序列，電泳圖見圖2。

如圖2所示，擴(kuò)增片段大小為650 bp。將所得序列在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，同時選取了擬層孔菌屬（Fomitopsis）、硫磺菌屬（Laetiporus） 等其他10株不同種真菌序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖2 供試菌株ITS擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of ITS sequence of test strain

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequence

如圖3所示，該菌株與梭倫剝管孔菌（MF445223.1） 相似性最高，為100%。因此確定該菌株為梭倫剝管孔菌。

2.3 最適溫度

不同培養(yǎng)溫度下NZ25菌株的菌絲長勢和生長速度見圖4、表1。

圖4 不同溫度對梭倫剝管孔菌菌絲生長的影響Fig.4 Effects of different temperature on mycelial growth of Piptoporus soloniensis

表1 不同溫度對菌株NZ25菌絲生長的影響Tab.1 Effects of different temperature on mycelial growth of strain NZ25

由圖4、表1可知，該菌株在15℃～35℃的溫度范圍內(nèi)均可以生長。菌絲平鋪型生長，邊緣整齊，菌落圓整，分泌淡黃色色素，初期白色，顏色逐漸從中間向邊緣擴(kuò)散，有特殊的皂香味；30℃菌絲生長速度最快，10℃條件下菌絲不生長。

2.4 最適pH

不同pH對菌株NZ25菌絲生長的影響見表2。

表2 不同pH對NZ25菌株菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different pH on mycelial growth of strain NZ25

由表2可知，在不同pH條件下，菌絲均是平鋪型生長，有皂香味，顏色淺黃色。在pH為8時，生長速度最快，顏色淺，但長勢弱；pH為5、6時，生長速度較慢，顏色深，長勢一般；pH為7時，生長速度中等，顏色較深，長勢強(qiáng)。結(jié)合菌絲生長速度和長勢，該菌株最適pH為7。

2.5 最適碳源

不同碳源對菌絲生長影響見表3和圖5。

表3 不同碳源對菌株NZ25菌絲生長的影響Tab.3 Effects of different carbon sources on mycelial growth of strain NZ25

由表3、圖5可知，菌絲均是平鋪型生長，均有香味，顏色由接種塊至邊緣擴(kuò)散，氣生菌絲不明顯，從菌絲生長速度來看，以甘露醇、葡糖糖為碳源時，菌絲生長速度最快，并且顏色均勻呈黃色、邊緣整齊；其次是麥芽糖，表現(xiàn)出菌落顏色淺、邊緣整齊。

圖5 不同碳源對菌株NZ25菌絲生長的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on mycelial growth of strain NZ25

2.6 最適氮源

不同氮源對菌絲生長的影響見表4。

表4 不同氮源對菌株NZ25菌絲生長的影響Tab.4 Effects of different nitrogen source on mycelial growth of strain NZ25

由表4可知，不同氮源對菌絲生長速度影響差異不明顯，菌絲平鋪型生長，有香味，顏色是由接種塊至邊緣擴(kuò)散，綜合比較，優(yōu)選牛肉膏做氮源。

2.7 最適無機(jī)鹽

試驗(yàn)菌株在不同無機(jī)鹽下的生長情況見表5。

由表5可知，菌絲均是平鋪型生長，均有香味，顏色淺黃色，菌落邊緣均較為整齊。從生長速度看，在硫酸鎂和氯化鈉培養(yǎng)基中，菌絲生長速度明顯高于其他處理（P＜0.05）。綜合生長速度和長勢，該菌株最適宜的無機(jī)鹽為硫酸鎂。

表5 不同無機(jī)鹽對菌株NZ25菌絲生長的影響Tab.5 Effects of different inorganic salt on mycelial growth of strain NZ25

2.8 最適生長因子

不同生長因子對菌絲生長影響見表6。

由表6可知，在4種培養(yǎng)基中，菌絲均以平鋪型生長，有香味，顏色淺黃色。在以VB1為添加條件時，菌落邊緣整齊，菌絲生長速度、生長勢和顏色優(yōu)于VC組和VE組。

表6 不同生長因子對菌株NZ25菌絲生長的影響Tab.6 Effects of different growth factor on mycelial growth of strain NZ25

3 結(jié)論

利用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行食用菌的初步鑒定和分類是傳統(tǒng)且初級的方法，但由于外界環(huán)境的不穩(wěn)定性，多種原因都可能會造成食用菌菌株的變異，從而造成食用菌較高的形態(tài)多樣性。因此傳統(tǒng)的分類方法無論是在子實(shí)體的形態(tài)特征、生長特性、理化指標(biāo)的描述，均會對菌物的鑒定存在誤差和分歧，即若只是從簡單的形態(tài)特征來對大型真菌鑒定具有局限性，尤其是在辨別形態(tài)上極為相近的種時，很難做出準(zhǔn)確的判斷、區(qū)分。而與現(xiàn)代分子生物技術(shù)相結(jié)合，即在DNA基礎(chǔ)上的ITS測序，就可以更好解決鑒定和分類的難題。利用ITS序列分析技術(shù)，通過PCR擴(kuò)增，序列測定可以實(shí)現(xiàn)樣品的分子鑒定，適用于不同分類水平的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究。

梭倫剝管孔菌由于與硫磺菌形態(tài)相似，在當(dāng)?shù)囟嗄陙硪恢北徽`認(rèn)為是硫磺菌，幼嫩時可食用，味道鮮美。通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，證實(shí)了該菌株屬于剝管孔菌屬的梭倫剝管孔菌（P.soloniensis）。通過菌絲體生長適宜條件研究，結(jié)果表明梭倫剝管孔菌對不同因子的選擇有差異，在碳源方面，甘露醇和葡萄糖是最適碳源，在生長速度和長勢方面均優(yōu)于其他碳源；梭倫剝管孔菌對有機(jī)氮有相對較好的利用，硝態(tài)氮利用一般，對銨態(tài)氮利用較差，一般來說在菌絲營養(yǎng)生長階段有機(jī)氮更有利于菌絲體生長；溫度試驗(yàn)表明梭倫剝管孔菌菌絲在15℃～35℃均能生長，在30℃左右時生長最好；在pH試驗(yàn)中，pH為7時生長較好。在對梭倫剝管孔菌的菌絲體培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)該菌絲體具有濃郁的皂香味，但關(guān)于梭倫剝管孔菌的研究報道在國內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)，這種香味的來源及該菌株的開發(fā)利用還有待于進(jìn)一步研究。