董玉婷， 陳泰任， 葉曉鋒， 黑常春， 蔡玉芳， 孔 斌， 趙承軍， 常 青

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，銀川 750004）

卵巢顆粒細胞（granulosa cells，GCs）是唯一與卵母細胞緊密相互作用的體細胞，廣泛參與原始卵泡募集、優(yōu)勢卵泡選擇、甾體激素分泌和卵泡閉鎖等過程，在卵泡發(fā)育和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。卵泡發(fā)育中晚期，卵巢顆粒細胞出現(xiàn)黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）。LHR屬G蛋白偶聯(lián)受體，黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和 LHR 的結(jié)合，激活卵巢顆粒細胞 cAMP/PKA、PLC/PKC、ERK1/2 等信號通路，誘導顆粒細胞中表皮生長因子樣配體（epidermal growth factor-like ligands，EGF-Ls）、孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）及活性氧（reactive oxygen species，ROS）等多種分子表達，參與卵母細胞減數(shù)分裂的重啟動、卵丘細胞的擴散、卵泡破裂、排卵和顆粒細胞黃體化等過程[3-4]，LH 或LHR 基因敲除使卵泡發(fā)育停滯在竇卵泡階段[5]，不發(fā)生排卵從而導致不孕[6]；高表達LH 或LHR 則導致顆粒細胞腫瘤的發(fā)生[7]。LH 對卵巢顆粒細胞具有多方面的影響，因此全面了解LH 對卵巢顆粒細胞的作用非常必要。

近年來，蛋白質(zhì)組學技術為卵巢相關研究提供了技術支持，如通過比較多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者與非PCOS患者血清蛋白表達水平的差異，有助于潛在血清標記物的發(fā)現(xiàn)[8]。本實驗采用非標記定量（labelfree quantification，LFQ）蛋白質(zhì)組學技術分析標本蛋白組分，對經(jīng)LH 干預的原代培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞進行蛋白表達譜的分析，以期發(fā)現(xiàn)LH 影響哪些顆粒細胞內(nèi)在的生物學過程和細胞信號通路，并對發(fā)現(xiàn)的部分差異表達蛋白進行了驗證，為后續(xù)的深入研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 21～25 d 的雌性 SD 大鼠（SPF級）由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供［動物合格證號: SCXK（寧）2019-0001］。本實驗嚴格按照中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局和中國國家標準化管理委員會發(fā)布的《實驗動物福利倫理審查指南》進行。

1.1.2 主要試劑 LH 購自 Sigma 公司；孕馬血清（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）購自Prospec-Tany 公司；DMEM/F-12 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和青鏈霉素均購自BI公司；兔抗Pard3 多克隆抗體購自Abcam 公司；兔抗Mark3 多克隆抗體購自Cell Signaling Technology（CST）公司；兔抗卵泡刺激素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、Gstp1 及 Nqo1多克隆抗體及兔抗β-Actin 抗體均購自武漢愛博泰克（Abclonal）生物科技有限公司。

1.1.3 分析軟件 利用生物信息學手段分析經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜得到的蛋白質(zhì)，分析使用的工具及其網(wǎng)址見表1。

表1 生物信息學分析軟件

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)及鑒定 大鼠原代卵巢顆粒細胞提取借鑒Zhang 等[9]的提取方法，取3 周齡的SD 雌性大鼠腹腔注射PMSG（10 IU/只）36 h 后，用頸椎脫臼法處死，剖取雙側(cè)卵巢，采用機械分離方法釋放卵巢顆粒細胞，分離出的顆粒細胞按 7×105個/mL 接種到培養(yǎng)皿/瓶中置于37 ℃，5%CO2條件下，用含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后以HE 染色觀察細胞形態(tài)，用FSHR 細胞免疫熒光染色鑒定所提取的顆粒細胞的純度，細胞純度=陽性細胞數(shù)量/計數(shù)細胞總數(shù)×100%，純度到達90%以上進行后續(xù)實驗。

1.2.2 蛋白提取及重復樣品一致性檢驗 將原代培養(yǎng)的顆粒細胞分為LH 組和對照組，其中LH組培養(yǎng)48 h 后，在培養(yǎng)基中加入0.3 IU·mL-1LH，干預3 h[10]，對照組用無菌PBS 代替。每組樣品經(jīng)超聲裂解，離心后取上清，使用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。采用Pearson 相關性和主成分分析（PCA）方法評估重復樣本一致性。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析 提取出的蛋白酶解成肽段后經(jīng)超高效液相系統(tǒng)（NanoE－lute）分離、Capillary 離子源電離后，進 tims-TOF Pro質(zhì)譜，在質(zhì)荷比100～1700 范圍內(nèi)掃描二級質(zhì)譜。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫檢索 二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行匹配分析，得到蛋白鑒定原始結(jié)果。

1.2.5 生物信息學分析 用非標定量計算方法計算蛋白在每個樣本中的非標記定量強度（LFQ intensity），得到每個樣本的相對定量值。通過重復樣本的相對定量值得到每個樣本的平均值，將兩組各樣本之間平均值的比值作為最終的差異表達量?；谠紨?shù)據(jù)P 值和差異表達量篩選差異蛋白，利用GO 注釋按照細胞成分、分子功能或生理進程對差異蛋白進行分類。同時，使用KEGG 標注工具KASS 對蛋白通路進行注釋，KEGG mapper 將差異蛋白匹配到數(shù)據(jù)庫中相應的KEGG 通路。

1.2.6 Western blot 驗證實驗 各組蛋白濃度測定后，調(diào)整為同一濃度，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳初步分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉后目的蛋白與其對應一抗（兔抗Pard3、兔抗Mark3、兔抗Gstp1、兔抗Nqo1 和兔抗β-Actin 稀釋濃度均為1∶1000）進行孵育，4 ℃過夜。清洗后 PVDF 膜在室溫下孵育第二抗體（山羊抗兔1∶5000）1 h，洗膜后用AI600 成像儀曝光后用圖像分析軟件（Image J 1.8.0.112）進行灰度值的分析。實驗重復 3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

1.3.1 差異蛋白篩選 將各個樣本的相對定量值取log（2使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布），采用t 檢驗計算P值，當 P≤0.05 時，以表達變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）變化＞1.5 作為顯著上調(diào)的閾值，＜0.67 作為顯著下調(diào)的閾值。

1.3.2 生物信息學分析 利用Fisher 精確雙端檢驗方法檢測差異表達蛋白對所有鑒定蛋白的富集，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。此時該差異蛋白被認為是顯著富集。

1.3.3 Western blot 結(jié)果分析 數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用t 檢驗，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠卵巢顆粒細胞鑒定及蛋白樣品一致性檢驗

大鼠卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)24 h 后貼壁生長，細胞呈星型或梭型（圖1A）；48 h 后，細胞呈單層生長，偽足相互伸展（圖1B）；HE 染色顯示大鼠卵泡顆粒細胞細胞核清晰，細胞邊界分明、形態(tài)結(jié)構完整（圖1C）。FHSR 免疫熒光染色后，鏡下可見FSHR 表達在細胞膜和細胞質(zhì)，呈現(xiàn)綠色細小顆粒，本實驗得到的細胞純度鑒定結(jié)果為（92.95±3.4）%，細胞純度達到后續(xù)實驗的要求（圖2）。蛋白定量主成分分析結(jié)果顯示，重復樣本之間的聚集程度定量重復性良好，且兩組間差異較大（圖3A），樣本間 Pearson 相關系數(shù)接近1，表明樣本重復性良好（圖3B）。

圖1 大鼠卵泡顆粒細胞的原代培養(yǎng)及形態(tài)觀察

圖2 原代大鼠卵巢顆粒細胞FHSR 免疫熒光鑒定

圖3 重復實驗樣本一致性檢驗

2.2 差異表達蛋白的篩選

與對照組比較，LH 組差異表達蛋白57 個，上調(diào)蛋白25 個，包括核糖體蛋白、組蛋白以及 Pard3 等（表 2）；下調(diào)蛋白 32 個，包括 Crk、Gstp1 和 Nqo1 等蛋白（表 3）。

2.3 差異表達蛋白的GO 分析

57 個差異表達蛋白中54 個的GO 標記可用，GO 二級注釋顯示，在分子功能（molecular function）層面，大部分差異蛋白具有結(jié)合活性與催化活性（圖4）。功能富集分析顯示，大部分差異蛋白在酶調(diào)節(jié)相關功能上有顯著的富集趨勢（圖5）。

2.4 KEGG 通路富集

分析差異表達蛋白在某一通路上是否過出現(xiàn)（over-presentation）即為差異表達蛋白的通路富集分析。本次實驗部分差異蛋白富集的信號通路包括過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK）信號通路、Hippo 信號通路、胰島素信號通路及癌癥相關信號通路等（圖6）。存在于這些信號通路上的差異表達蛋白的具體信息見表4。

表2 LH 組與對照組間表達上調(diào)差異蛋白（n=3）

表3 LH 組與對照組間表達下調(diào)差異蛋白（n=3）

續(xù)表

圖4 差異表達蛋白在GO 二級分類中統(tǒng)計分布圖

圖5 差異表達蛋白在GO 功能分類中富集分布氣泡圖

2.5 Western blot 驗證差異蛋白表達

以上蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果表明，與對照組比較，LH 組中 Pard3 和 Mark3 表達上調(diào)，Gstp1 和Nqo1 表達下調(diào)。Western blot 驗證實驗結(jié)果見圖7。

圖6 部分差異表達蛋白富集的信號通路

表4 部分差異蛋白富集的信號通路具體信息

3 討論

卵泡發(fā)育過程中，LH 對卵巢顆粒細胞的調(diào)控作用至關重要。在穩(wěn)定可靠的大鼠卵巢原代顆粒細胞培養(yǎng)的基礎上，本研究通過蛋白質(zhì)組學方法發(fā)現(xiàn)，LH 干預顆粒細胞后差異表達蛋白共有57 個，其中25個表達上調(diào)，32 個表達下調(diào)。多個核糖體蛋白表達增高，說明LH 可促進顆粒細胞蛋白質(zhì)合成功能。同時發(fā)現(xiàn)數(shù)個組蛋白和細胞增殖的相關分子表達上調(diào)，說明LH 可促進DNA的復制和細胞增殖。表達下調(diào)的蛋白涉及能量代謝、離子轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)降解等過程，這一結(jié)果說明，LH 對顆粒細胞相關功能具有抑制作用。

GO 注釋及功能富集分析顯示，大部分差異蛋白的功能與細胞結(jié)合、酶催化能力和分子功能調(diào)節(jié)有關，說明LH 作用于顆粒細胞，通過相關分子功能的調(diào)節(jié)，可改變顆粒細胞間相互結(jié)合的方式以及激素的合成能力。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，差異表達的蛋白質(zhì)參與多個細胞信號通路，包括胰島素信號通路、Hippo 信號通路和MAPK信號通路等。研究[11]表明，小鼠卵巢顆粒細胞產(chǎn)生胰島素抵抗能夠抑制MAPK 信號通路，下調(diào)細胞色素 P450c17α（cytochrome P450，family 17，subfamily A，polypeptide 1，CYP17A1）的表達，降低孕酮的產(chǎn)生。Hippo 信號通路在排卵過程中調(diào)控卵巢顆粒細胞增殖和分化[12]，這些信號通路在調(diào)節(jié)顆粒細胞功能和卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。同時也發(fā)現(xiàn)了數(shù)個在卵巢研究中較少涉及的信號通路，如 PPARs、Rap1 和 Chemokine 等信號通路，為深入研究LH 對顆粒細胞的作用提供了有價值的線索。

圖7 LH 對大鼠卵巢顆粒細胞Pard3、Mark3、Gstp1 以及Nqo1 蛋白表達影響

在本研究驗證的4 個差異表達的蛋白中，Pard3 是一種細胞極性蛋白，在維持細胞間緊密連接的同時也控制著細胞的新陳代謝與增殖[13]。結(jié)合KEGG 結(jié)果，Pard3 參與 Hippo 信號通路的調(diào)節(jié)。研究[14]發(fā)現(xiàn)，Pard3 會導致Hippo 信號通路主要效應分子TAZ 去磷酸化，觸發(fā)細胞接觸和細胞極性信號，從而促進細胞生長。這一結(jié)果提示，LH 可通過上調(diào)顆粒細胞Pard3 的表達，增強顆粒細胞極性；另一差異表達上調(diào)蛋白Mark3 也被證實與細胞極性相關，并參與細胞周期調(diào)節(jié)和Ras 信號傳導[15-16]。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，Mark3 通過抑制Mst1/2 活性來抑制 Hippo 信號通路，提示LH可通過上調(diào)Mark3 的表達抑制Hippo 信號通路繼而產(chǎn)生促卵泡生長效應。下調(diào)蛋白Gstp1 和Nqo1 被認為是抗氧化標記物，Gstp1 和Nqo1 可減少活性氧的形成，從而抑制氧化應激反應[18-19]。過高的氧化應激反應會引起卵巢顆粒細胞損傷[20]，進而誘導顆粒細胞凋亡導致卵泡閉鎖[21]。本研究驗證的4 個差異表達蛋白，為進一步從顆粒細胞極性、增殖和氧化應激角度深入研究LH的作用提供了基礎。

綜上，LH 作用于顆粒細胞，可影響細胞極性、蛋白合成及能量代謝等多個相關蛋白表達，涉及MAPK、Hippo 及胰島素等多條信號通路，提示LH 通過影響顆粒細胞增殖、細胞周期、激素合成能力和抗氧化能力等對卵巢顆粒細胞功能發(fā)揮重要作用。