方丹丹， 楊 華， 李 元， 路玉祥， 李西艷， 楊 麗， 楚元奎

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，銀川 750004）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全世界男性患者最常見的惡性腫瘤，在男性腫瘤患者中的發(fā)病率和病死率中分別位于第2 位和第4 位[1]。2015 年我國PCa 新發(fā)病例數(shù)約為60300 例，死亡人數(shù)約為26600 例，新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)均排在男性泌尿系統(tǒng)腫瘤的第2 位[2]。盡管早期PCa 經(jīng)過局部手術(shù)可達到較好的治療效果，但部分患者隨著病情進展需采用雄激素剝奪療法。經(jīng)過18～24 個月雄激素剝奪法治療后，PCa 最終發(fā)展為雄激素非依賴性PCa，這類患者治療及預(yù)后均較差，臨床上尚無有效的治療方法[3]。因此，進一步揭示PCa 發(fā)生、發(fā)展的分子機制，將有助于提高其臨床診斷和治療水平。

微小 RNA（microRNAs，miRNAs）是一類高保守內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，長度約為18～25 個核苷酸，可通過與靶基因序列互補結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成分。多種miRNAs 參與了PCa 的發(fā)生、發(fā)展，在PCa 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[4-8]。已有研究[9-11]表明，miR-3064-5p 在肝癌和胃癌細(xì)胞生長調(diào)控中發(fā)揮抑癌作用。目前miR-3064-5p 在PCa 細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移中的作用仍不明確。本研究旨在進一步闡明miR-3064-5p 在PCa 細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移中的作用并探討其分子機制，以期為PCa 的診斷和治療尋找新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人PCa 細(xì)胞株P(guān)C3、DU145、正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1 及K-SFM 培養(yǎng)液購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（中國上海）。胎牛血清和RPMI-1640 培養(yǎng)基購自GIBCO 公司；mimic nc 及 miR-3064-5p mimic、靶向真核翻譯起始因子5（EIF5）雙熒光素酶報告載體由廣州銳博生物科技有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自美國 Invitrogen 公司；Trizol試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；HiS-cript II Q RT SuperMix for qPCR 和ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購自諾唯贊公司；兔抗人EIF5抗體、鼠抗人GAPDH 抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自美國ProteinTech-Group 公司；總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Dual-GloRLuciferase Assay System試劑盒購自美國Promega 公司；miR-3064-5p 序列來源于NCBI 網(wǎng)站，檢測引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 PC3 和DU145 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，RWPE-1 細(xì)胞培養(yǎng)于K-SFM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2的恒溫、恒濕環(huán)境。選取對數(shù)期生長的PC3 細(xì)胞以相應(yīng)密度接種于60 mm 培養(yǎng)皿和6 孔板中，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h 貼壁后按照Lipofectamine 2000 試劑操作說明書進行轉(zhuǎn)染，將PC3細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染mimic nc 組及miR-3064-5p mimic 組，48 h 后收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 Trizol 法提取各實驗組細(xì)胞總RNA 并測定其濃度。按照HiScriptIIQRTSuperMix for qPCR 和ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說明書對上述RNA 進行反轉(zhuǎn)錄和PCR 檢測。miR-3064-5p 反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACG-3′；miR-3064-5p 上游引物：5′-TGTGGCTGTTGTGGTGTGC-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6 上游引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′；EIF5 上游引物：5′-GTTCTATCGCTACAAGATGCCC-3′，下游引物：5′-CTCCCAGCTCACAACCAAAA-3′；GAPDH上游引物：5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游引物：5′-ATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，58 ℃ 25 s，70 ℃25 s，36 個循環(huán)；72 ℃10 min。實驗重復(fù) 3次，2-ΔΔCt法計算 miR-3064-5p 和 EIF5 的相對表達量，小核RNA U6（U6）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）分別作為內(nèi)參。

1.2.3 細(xì)胞克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的PC3 細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，以 600 個細(xì)胞/孔的密度接種于12 孔板中，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 貼壁后，Lipofectamine 2000 法轉(zhuǎn)染 mimic nc 及miR-3064-5p mimic。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 10～14 d，每隔3 d換1 次液。PBS 清洗細(xì)胞3 次，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色 3～4 min，PBS 清洗 3 次，干燥后計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，并計算克隆形成率。

1.2.4 MTT 實驗 將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于4個96 孔板中，每組6 個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染mimic nc 及 miR-3064-5p mimic，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 和 96 h、每孔加入 30 μL MTT 試劑，37 ℃放置 4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入 150 μL 二甲基亞砜，在酶標(biāo)儀490 nm 處測各孔光密度（OD）值。

1.2.5 劃痕愈合實驗 取對數(shù)生長期的PC3 細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，以2×105個細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔板中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后轉(zhuǎn)染mimic nc 及 miR-3064-5p mimic，使用 200 μL 黃色槍頭各孔平行劃3 條線。隨后，PBS 清洗3 次，加入RPMI-1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。100×光鏡下于指定時間在指定位置對各孔進行拍照，測量各組劃痕寬度后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.6 Transwell 實驗 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染mimic nc及miR-3064-5p mimic 后，消化接種于Transwell小室中，每個小室 5×104個細(xì)胞，培養(yǎng) 24 h 后PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS 清洗2 次后用棉簽擦凈小室膜上方細(xì)胞，干燥后400×光鏡下隨機選取5 個視野拍照并計數(shù)進行分析。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 構(gòu)建分別含EIF53’-UTR 野生型（EIF5-WT）和突變型（EIF5-Mut）序列的雙熒光素酶報告載體（廣州銳博生物科技有限公司）。選取對數(shù)期生長的293T 細(xì)胞以1.5×104/孔的密度接種于 96 孔板中，培養(yǎng)24 h 細(xì)胞貼壁后，脂質(zhì)體法將構(gòu)建的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體分別與mimic nc 及miR-3064-5p mimic 共轉(zhuǎn)染入293T 細(xì)胞。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用 Promega 公司的 Dual-Glo?Luciferase Assay System 試劑盒檢測各組細(xì)胞的雙熒光素酶基因活性，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.2.8 Western blot 檢測 分別收取轉(zhuǎn)染mimic nc 及 miR-3064-5p mimic 培養(yǎng) 72 h 后的 PC3 細(xì)胞，Western blot 法檢測 EIF5 和 GAPDH 的表達。蛋白裂解液RIPA 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測其濃度并計算上樣量，隨后進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠70 V 電泳60 min，分離膠100 V 電泳 60 min，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，300 mA 115 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入適當(dāng)濃度的一抗4 ℃孵育過夜，PBST 清洗3 遍后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。PBS 漂洗后ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 19.0 和 Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗重復(fù)3 次，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-3064-5p 在PCa 細(xì)胞中低表達

miR-3064-5p 在 PCa 細(xì)胞系 PC3、DU145 中的表達水平低于正常前列腺上皮RWPE-1 細(xì)胞（P 均＜0.01），見圖 1A。miR-3064-5p 的表達在 PC3和DU145 細(xì)胞中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）。本研究選擇PC3 細(xì)胞作為后續(xù)研究對象。將PC3細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染mimic nc 及miR-3064-5p mimic，miR-3064-5p mimic 組 miR-3064-5p 的表達水平較 mimic nc 組升高（P＜0.001），見圖 1B。

2.2 miR-3064-5p 抑制PC3 細(xì)胞的增殖

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，與mimic nc 組相比，miR-3064-5p mimic 組細(xì)胞克隆形成數(shù)量減少（圖 2A）。MTT 實驗結(jié)果顯示，mimic nc 組PC3 細(xì)胞生長變緩，在 96 h 時 miR-3064-5p mimic 組與mimic nc 組OD 值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖 2B。

2.3 miR-3064-5p 抑制PC3 細(xì)胞的遷移和侵襲

劃痕及Transwell 實驗結(jié)果顯示，與mimic nc組相比，miR-3064-5p mimic 組細(xì)胞的遷移侵襲能力降低（P 均＜0.05），見圖 3。

2.4 miR-3064-5p 靶向作用于EIF5 基因

圖1 miR-3064-5p 的相對表達水平

圖2 miR-3064-5p 對PC3 細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 miR-3064-5p 對PC3 細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

使用Starbase 在線預(yù)測miR-3064-5p 潛在靶基因，結(jié)果顯示，EIF5 可能是miR-3064-5p的一個下游靶標(biāo)。構(gòu)建EIF5-WT 和EIF5-Mut 雙熒光素酶報告載體，將兩者分別與mimic nc 及miR-3064-5p mimic 共轉(zhuǎn)染入PC3 細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染miR-3064-5p mimic 和EIF5-WT 組熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染 mimic nc 與 EIF5-WT 組降低（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染 miR-3064-5p mimic 和 EIF5-Mut組的熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染mimic nc 和EIF5-Mut 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖 4A。miR-3064-5p 高表達后，EIF5 在 mRNA 水平和蛋白水平表達均降低（圖4B、圖4C）。

圖4 miR-3064-5p 與EIF5 靶向關(guān)系驗證

3 討論

miRNAs 廣泛參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物過程[7-11]，目前關(guān)于miR-3064-5p 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展調(diào)控中的作用報道較少。Zhang 等[9]報道，miR-3064-5p 在肝癌組織與細(xì)胞系中表達降低，miR-3064-5p 的過表達可通過靶向調(diào)節(jié)FOXA1/CD24/Src 通路有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖并控制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。Wang 和 Sun 等[10-11]發(fā)現(xiàn)，在胃癌中miR-3064-5p 通過調(diào)控下游靶基因PTPN14、COL6A3 的表達起到抑癌作用。而miR-3064-5p 在PCa 細(xì)胞中的表達水平和生物學(xué)功能尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-3064-5p 在PCa 細(xì)胞PC3 和DU145 中的表達低于正常前列腺上皮細(xì)胞，進一步功能實驗驗證，過表達miR-3064-5p可抑制PC3 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，表明miR-3064-5p 在PC3 細(xì)胞生長調(diào)控中發(fā)揮抑癌作用。

miRNAs 可通過與靶基因序列互補結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。為進一步明確miR-3064-5p 抑制PCa 細(xì)胞增殖和遷移的分子機制，通過Starbase 生信分析miR-3064-5p 下游靶點，顯示EIF5 為miR-3064-5p 潛在靶基因。EIF5 屬于真核翻譯起始因子（EIFs）家族，該家族成員通過互相配合調(diào)控mRNA 翻譯的啟動，從而影響真核基因表達。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的EIFs 有EIF1、EIF1a、EIF2、EIF2b、EIF3、EIF4a、EIF4e、EIF4g、EIF4b、EIF4h、EIF5 和 EIF5b[12]。EIFs 的失調(diào)會導(dǎo)致多種疾病。許多腫瘤中EIFs 復(fù)合物的活性都顯示異常，EIFs 的表達異常進而使腫瘤相關(guān)蛋白的mRNA 發(fā)生選擇性翻譯[13]。本研究關(guān)注的目標(biāo)基因EIF5 可通過與40S 起始復(fù)合物相互作用，并伴隨著60S 核糖體亞基與40S 起始復(fù)合物的結(jié)合，促進結(jié)合的鳥嘌呤三核苷酸磷酸水解。所得的功能性80S 核糖體起始復(fù)合物隨后在肽基轉(zhuǎn)移和鏈延長中具有活性[14]。Song 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在腎透明細(xì)胞癌中，miR-107 靶向結(jié)合EIF5抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。Huang 等[16]發(fā)現(xiàn)，circRNA-100338 通過激活mTOR 信號通路促進EIF5 的表達，進而促進肝細(xì)胞癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。上述研究表明，EIF5 在多種癌癥中發(fā)揮促癌作用。本研究通過雙熒光素酶報告實驗、qRT-PCR 和Western blot 檢測證實 miR-3064-5p 與 EIF5 基因間存在靶向結(jié)合位點，同時也證明了miR-3064-5p 在PC3 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮抑制作用，這種抑制作用可能是通過下調(diào)EIF5 基因的表達實現(xiàn)。

綜上所述，miR-3064-5p 在PCa 細(xì)胞中低表達，過表達miR-3064-5p 可能通過下調(diào)EIF5 的表達抑制PC3 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，上述結(jié)果可為PCa 的診斷和治療提供新的思路。