鄧姝穎， 白莉莉， 薛 陽(yáng)， 陳 康， 蔡慧珍

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，銀川 750004）

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一種以葡萄糖依賴的方式增加胰島素分泌[1]，同時(shí)還抑制胰高血糖素分泌[2]，由此對(duì)血糖水平進(jìn)行調(diào)控的內(nèi)分泌激素。2 型糖尿病（T2DM）患者的主要特征是由腸道L 細(xì)胞釋放的GLP-1 水平降低。GLP-1 被 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路下游靶基因GCG 基因編碼，其分泌受到Wnt/β-catenin 通路的調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)腺苷酸結(jié)合蛋白（Epac）二者相互作用，在胰島素分泌調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演重要角色[3]。研究表明[4-5]，cAMP 與 Epac 蛋白的表達(dá)與GCG 基因的轉(zhuǎn)錄以及GLP-1 的產(chǎn)生之間也存在某些聯(lián)系。枸杞多糖（LBP）的降糖作用在本課題組前期實(shí)驗(yàn)[6]中已得到證實(shí)，但其具體作用機(jī)制還有待明確。因此，本實(shí)驗(yàn)在GCG 基因轉(zhuǎn)錄的水平分別從Wnt/β-catenin 信號(hào)通路及cAMP/Epac途徑研究LBP 對(duì)GCG mRNA 的影響，推測(cè)LBP 可能通過(guò)這兩種途徑影響GCG 基因的表達(dá)，進(jìn)而參與GLP-1 的降糖作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞（STC-1）購(gòu)于上海名勁生物科技有限公司；高糖DMEM、胎牛血清（FBS）、PBS 購(gòu)于以色列BI 公司；LBP 購(gòu)于上海源葉生物有限公司；胰酶、雙抗購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞裂解液NP-40、PMSF 購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；βcatenin、FOXO4、TCF7L2、β-actin 抗體、重組蛋白Wnt3a 購(gòu)于美國(guó)abcam 公司；通用抗體稀釋液購(gòu)于新塞美科技有限公司；二抗、熒光二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物公司；PVDF 膜購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司；含DAPI 的抗熒光衰減封片劑購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；免疫共沉淀試劑盒購(gòu)于愛(ài)必信（上海）生物技術(shù)有限公司；β-actin、GCG 基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrineScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenR Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）購(gòu)于日本TaKaRa 公司；GLP-1 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

STC-1 細(xì)胞在高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入10%FBS 和 1%雙抗。在 37°C，5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞全蛋白、細(xì)胞核蛋白以及細(xì)胞質(zhì)蛋白中β-catenin 蛋白的檢測(cè)

在75T 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中將STC-1 細(xì)胞培養(yǎng)至60%左右，用無(wú)血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h 使細(xì)胞處于同一生長(zhǎng)期。不同培養(yǎng)基（分別含有 0、25、50 和 100 μg·mL-1LBP 的 DMEM 培養(yǎng)液，1%雙抗，10%胎牛血清）孵育24 h。配制含有1 mmol·L-1PMSF 的 NP-40 裂解緩沖液提取總蛋白。利用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。BCA 蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入70 μg 蛋白樣品至8%的SDSPAGE 凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶（PBST 配制）封閉 1 h 后，加 β-catenin一抗（1∶5000）4 °C 過(guò)夜孵育。PBST 洗膜 3 次，1∶4000 稀釋二抗室溫孵育1 h。滴加ECL 發(fā)光顯影液，BIO-RAD 成像系統(tǒng)拍照，Image J 分析條帶灰度值，計(jì)算β-catenin 與β-actin 灰度值的比值。

1.4 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞全蛋白中cAMP、Epac蛋白的表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)條件同1.2。待細(xì)胞長(zhǎng)至25T 培養(yǎng)瓶底部60%左右，使用不含血清的高糖DMEM同步細(xì)胞6 h，使細(xì)胞處于同一生長(zhǎng)期。不同培養(yǎng)基（分別含有 0、25、50 和 100 μg·mL-1LBP 的DMEM培養(yǎng)液，1%雙抗，10%胎牛血清）孵育24 h。干預(yù)結(jié)束后，使用含有 1 mmol·L-1PMSF 的 NP-40裂解緩沖液提取總蛋白，BCA 蛋白濃度試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入30 μg 蛋白樣品至8%的SDS-PAGE凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移到0.45 μgPVDF 膜上，5%脫脂牛奶（PBST 配制）封閉 1 h 后，加 β-catenin 一抗（cAMP 1∶20000；Epac 1∶1000）4 ℃過(guò)夜孵育。PBST洗膜 3 次，1∶4000 稀釋二抗室溫孵育 1 h。滴加ECL 發(fā)光顯影液，BIO-RAD 成像系統(tǒng)拍照，Image J分析條帶灰度值，分別計(jì)算cAMP 和Epac 與βactin 灰度值的比值。

1.5 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin 的原位表達(dá)

在24 孔板中放入蓋玻片，將細(xì)胞均勻種板于24 孔板中，加入含10% FBS 的培養(yǎng)基孵育24 h。再用無(wú)血清高糖DMEM 細(xì)胞同步化6 h 后改為分別含有 0、25、50 和 100 μg·mL-1的 LBP 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛中固定15 min，然后在室溫下用0.5% Triton X-100 處理20 min。PBS浸洗后，山羊血清室溫孵育30 min。加入β-catenin一抗（1∶250）后 4 °C 避光孵育一夜。熒光二抗（1∶25） 在室溫下孵育 1 h 后，PBS 浸洗 3 次，每次3 min。滴加10 μL 含DAPI 的抗熒光衰減封片劑于載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一側(cè)向下使封片劑充盈于蓋玻片與載玻片中間，除盡氣泡。最后，在熒光顯微鏡下觀察和收集圖像，對(duì)βcatenin 蛋白的原位表達(dá)進(jìn)行定性分析。

1.6 免疫共沉淀法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4、TCF7L2與 β-catenin 的結(jié)合

將STC-1 細(xì)胞分為4 組，分別為空白對(duì)照組、重組蛋白 Wnt3a 組（含 50 ng·mL-1重組蛋白Wnt3a）、LBP 組（含 100 μg·mL-1LBP）和 LBP 聯(lián)合重組蛋白 Wnt3a 組（含 100 μg·mL-1LBP 和50 ng·mL-1重組蛋白 Wnt3a）培養(yǎng) 24 h。用含有1 mmol·L-1PMSF 的 NP-40 裂解緩沖液制備蛋白樣品。將蛋白A 和蛋白G 加入蛋白樣品中，4°C下孵育 40 min。4 °C 條件下以 12000×g 速度離心1 min 保留上清液。將FOXO4 一抗或TCF7L2 一抗分別加入上清液中，4 °C 下孵育一夜，再次加入蛋白A 和蛋白G，4 ℃過(guò)夜。上清液在12000×g速度下離心1 min，棄上清液。用預(yù)冷的PBS 重復(fù)洗滌沉淀物3 次。用1% SDS 樣品緩沖液（Tris-HCl pH7.5，含 0.5 mmol·L-1EDTA 和 1 mmol·L-1DTT）重懸沉淀，100 ℃沸水浴10 min 使蛋白變性。將20 μL 準(zhǔn)備好的蛋白樣品至8%凝膠中，后續(xù)操作同1.3。Image J 分析條帶灰度值，計(jì)算β-catenin 與 β-actin 灰度值的比值。

1.7 細(xì)胞上清液中GLP-1 表達(dá)水平的檢測(cè)

將 STC-1 細(xì)胞分為 4 組，分別使用含0、25、50、100 μg·mL-1LBP 的完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。根據(jù)伊萊瑞特試劑盒中的說(shuō)明，對(duì)GLP-1的濃度進(jìn)行測(cè)試。

1.8 RT-PCR

將 STC-1 細(xì)胞分為 4 組，分別使用含0、25、50、100 μg·mL-1LBP 的完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。使用TaKaRa RNA 提取試劑盒，采用柱式提取法從細(xì)胞中提取總RNA。核酸蛋白儀檢測(cè)RNA濃度及純度；根據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將一部分RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，另一部分-80 ℃保存。GCG的引物序列為GCG-F：GCACATTCACCAGC GACTA；GCG-R：TGACGTTTGGCAATGTTC；以β-actin 為內(nèi)參，其序列為 β-actin-F：GGTCATCACTATTGGCAACG；β -actin -R：ACGGATGTCAACGTCACACT。根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒中操作步驟配制反應(yīng)體系，PCR 程序?yàn)椋篠tep1：95 ℃，30 s；Step2：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共 40 個(gè)循環(huán) ，95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；Step3：溶解曲線。GCG mRNA水平的計(jì)算采用相對(duì)表達(dá)量RQ=2-ΔΔCt值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組樣本間均值的比較采用One-Way ANOVA 方法，兩兩比較采用LSD 法。采用析因方差分析對(duì)免疫共沉淀結(jié)果進(jìn)行分析，兩組間獨(dú)立樣本采用t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LBP 對(duì)STC-1 細(xì)胞干預(yù)后全蛋白、核蛋白、質(zhì)蛋白中β-catenin 表達(dá)水平比較

不同濃度LBP 干預(yù)下，STC-1 細(xì)胞中全蛋白、核蛋白和質(zhì)蛋白中β-catenin 的含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F全=23.622，F(xiàn)核=45.026，F(xiàn)質(zhì)=305.644，P 均＜0.01）。與 0 μg·mL-1組（空白對(duì)照組）比較，50 μg·mL-1、100 μg·mL-1LBP 干預(yù)下全蛋白、核蛋白及質(zhì)蛋白中β-catenin 表達(dá)均增加（P 均＜0.05），見(jiàn)圖 1。

2.2 不同濃度 LBP 對(duì) STC-1 細(xì)胞中 cAMP、Epac 蛋白表達(dá)的影響

由圖2 可見(jiàn)，各組 cAMP、Epac 蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FcAMP=46.644，F(xiàn)Epac=268.229，P 均＜0.01）。隨著 LBP 干預(yù)濃度的增加，cAMP、Epac 蛋白表達(dá)水平也隨之增加。與0 μg·mL-1組（空白對(duì)照組）相比，各 LBP 干預(yù)組 cAMP、Epac 蛋白表達(dá)水平均增高（P 均＜0.05）。

2.3 免疫熒光法檢測(cè)不同濃度LBP 對(duì)β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)位的影響

由圖3 可見(jiàn)，在空白對(duì)照組和25 μg·mL-1LBP干預(yù)的條件下，Cy3（紅色熒光）所標(biāo)記的β-catenin集中在細(xì)胞核周圍。在LBP 干預(yù)后，細(xì)胞中紅色熒光強(qiáng)度隨LBP 濃度的增加而增強(qiáng)，細(xì)胞核內(nèi)紅色熒光Cy3 強(qiáng)度也隨之增加，表明LBP 可能刺激了β-catenin 分泌進(jìn)而遷移到細(xì)胞核中。

圖1 不同濃度LBP 對(duì)STC-1 細(xì)胞干預(yù)后全蛋白、核蛋白、質(zhì)蛋白中β-catenin 表達(dá)水平

圖2 不同濃度LBP 對(duì)STC-1 細(xì)胞干預(yù)后cAMP、Epac 蛋白的表達(dá)水平

圖3 不同濃度LBP 對(duì)β-catenin 蛋白核轉(zhuǎn)位的影響（×100）

2.4 免疫共沉淀檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2、FOXO4與β-catenin 結(jié)合情況

將重組蛋白Wnt3a 干預(yù)組設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組，由表 1、表 2 可知，LBP 與重組蛋白 Wnt3a 之間存在相互作用（見(jiàn)圖4）。在無(wú)LBP 和重組蛋白Wnt3a 干預(yù)的情況下（即空白對(duì)照組），可以檢測(cè)到FOXO4 和TCF7L2 與β-catenin 的復(fù)合物。重組蛋白Wnt3a 干預(yù)后，F(xiàn)OXO4 抗體沉淀的二聚體中 β-catenin 的表達(dá)增加（P＜0.001）。經(jīng) LBP 干預(yù)后，細(xì)胞中β-catenin 與轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2 的復(fù)合物水平較空白對(duì)照組增加（P=0.001）。經(jīng)LBP干預(yù)后的FOXO4/β-catenin 二聚體與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.085）。LBP 和重組蛋白Wnt3a 聯(lián)合干預(yù)后，β-catenin 與TCF7L2的結(jié)合物較空白對(duì)照組增加，F(xiàn)OXO4/β-catenin復(fù)合物表達(dá)水平較空白對(duì)照組降低（P 均＜0.01）。

2.5 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)STC-1 細(xì)胞中GCG 基因的表達(dá)

為進(jìn)一步研究LBP 對(duì)Wnt 信號(hào)通路中GCG 基因的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)GCG 基因的表達(dá)。結(jié)果表明，隨著LBP 濃度的增加，GCG基因的表達(dá)逐漸增加。50 μg·mL-1和 100 μg·mL-1LBP 干預(yù)下，GCG 基因表達(dá)均較空白對(duì)照組增加（P 均＜0.05），見(jiàn)圖 5。

2.6 STC-1 細(xì)胞上清液中GLP-1 的表達(dá)水平

ELISA 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，50 和100 μg·mL-1LBP 干預(yù)下上清液中 GLP-1 的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。當(dāng)LBP干預(yù)濃度為25 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞上清液中的GLP-1的表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖 6。

表 1 各組干預(yù)后FOXO4/β-catenin 二聚體的表達(dá)水平

表2 各組干預(yù)后TCF7L2/β-catenin 二聚體的表達(dá)水平

圖 4 轉(zhuǎn)錄因子FOXO4、TCF7L2 與β-catenin 結(jié)合情況

圖 5 STC-1 細(xì)胞中GCG 基因的表達(dá)水平比較

3 討論

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與調(diào)控增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)過(guò)程[7]。該途徑與多種疾病相關(guān)，如糖尿病及其相關(guān)疾病[8-9]、癌癥[10-12]、自身免疫性疾病[13-14]等。β-catenin 蛋白作為Wnt/β-catenin 信號(hào)通路上的關(guān)鍵開(kāi)關(guān)，β-catenin蛋白入核是激活Wnt/β-catenin 通路的關(guān)鍵步驟[15]。本研究使用LBP 干預(yù)STC-1 細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中β-catenin 蛋白的濃度增加。LBP 刺激β-catenin 蛋白易位進(jìn)入細(xì)胞核，說(shuō)明LBP 可能通過(guò)上調(diào)β-catenin 的表達(dá)以及促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)位，從而激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。

在小鼠小腸上皮細(xì)胞中，β-catenin 入核后與T 細(xì)胞因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成β-catenin/TCF 二聚體，激活下游靶基因[16]。轉(zhuǎn)錄因子FOXOs 與β-catenin 的結(jié)合將競(jìng)爭(zhēng)性地抑制轉(zhuǎn)錄因子TCF 與β-catenin 的結(jié)合，導(dǎo)致受Wnt 信號(hào)通路調(diào)控的靶基因的轉(zhuǎn)錄活性降低[17]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了LBP 干預(yù)下轉(zhuǎn)錄因子FOXO4 和 TCF7L2 與 β-catenin 蛋白的結(jié)合情況，結(jié)果表明，LBP 能有效地增加轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2與 β-catenin 的結(jié)合，提高β-catenin/TCF 二聚體的含量。這一結(jié)果與徐佳慧[18]在胃癌中的研究相似，進(jìn)一步表明LBP 可能對(duì)Wnt 信號(hào)通路有一定的影響。

在 Wnt 信號(hào)通路的下游，β-catenin/TCF 二聚體可以調(diào)節(jié)GCG 的表達(dá)[19]。β-catenin/TCF 二聚體與GCG 基因增強(qiáng)子G2 序列結(jié)合，調(diào)控GCG 基因的轉(zhuǎn)錄[20]。為了驗(yàn)證LBP 是否可以通過(guò)增加β-catenin/TCF 二聚體來(lái)上調(diào)GCG 基因的表達(dá)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路，本研究觀察了不同濃度的LBP 對(duì)STC-1 細(xì)胞中GCG 基因的影響。結(jié)果表明，LBP 能有效調(diào)控細(xì)胞GCG 基因的表達(dá)。

圖 6 STC-1 細(xì)胞上清液中GLP-1 的表達(dá)水平

cAMP 是GCG 編碼肽激素的影響因素之一[21]，Epac 為cAMP 的影響因子之一，也是調(diào)節(jié)GLP-1分泌的重要因素。研究表明[22-23]，在一些胰腺α和腸道內(nèi)分泌L 細(xì)胞中，cAMP 升高能促使GCG mRNA 的表達(dá)和啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄增加；同時(shí)有學(xué)者研究了Epac 在刺激GCG 轉(zhuǎn)錄、胰高血糖素和GLP-1 產(chǎn)生中的作用[24-25]。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，LBP 可能通過(guò)上調(diào) cAMP、Epac 蛋白的水平，進(jìn)一步刺激GCG 基因的表達(dá)以及GLP-1的分泌。

由GCG 基因編碼的GLP-1 不僅能夠增加胰島素的分泌，同時(shí)也能提高細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，并保護(hù)胰島細(xì)胞免受損傷，為使用胰島素治療2 型糖尿病提供科學(xué)依據(jù)[1]。目前已有研究[26]表明，多糖對(duì) Wnt/β-catenin 信號(hào)通路、cAMP/Epac 確有影響，同時(shí)GCG 基因?qū)LP-1 的調(diào)控作用也已證實(shí)。但目前還未見(jiàn)關(guān)于多糖影響GLP-1 分泌的系統(tǒng)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度LBP 干預(yù)STC-1 細(xì)胞后，GLP-1 水平是否隨 LBP 濃度增加而改變。結(jié)果表明，GLP-1 的變化趨勢(shì)與GCG基因的表達(dá)趨勢(shì)一致，提示W(wǎng)nt 信號(hào)通路以及cAMP/Epac 可能參與了LBP 誘導(dǎo)的GLP-1 分泌。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò) Wnt/β-catenin、cAMP/Epac信號(hào)通路，探討LBP 對(duì)GCG 基因的影響，從而研究對(duì)GLP-1 分泌的影響。從β-catenin 蛋白的表達(dá)、TCF7L2/β-catenin 二聚體的形成、GCG 基因的表達(dá)和GLP-1 分泌系統(tǒng)地研究了LBP 對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBP 可以通過(guò)刺激Wnt 信號(hào)通路來(lái)增加β-catenin 蛋白的分泌，從而促進(jìn)TCF/β-catenin 二聚體的形成，進(jìn)而上調(diào)GCG基因的表達(dá)，增加GLP-1 的濃度，同時(shí)也能通過(guò)上調(diào)cAMP 與Epac 蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而影響GCG 基因以及GLP-1 的表達(dá)與分泌。本研究為L(zhǎng)BP 治療T2DM 的機(jī)制提供新的證據(jù)。