劉俊彤，湯業(yè)珍，彭 茜，韓懷欽，梁錦屏，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床病原生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種慢性傳染病，估算全球約有17億人感染結(jié)核分枝桿菌，我國(guó)每年新發(fā)病例約為130萬(wàn)，居全球第二位[1]。結(jié)核病耐藥菌株的高發(fā)病率[2]以及MTB與HIV共感染是目前面對(duì)的棘手問(wèn)題[3]。因此，需要尋求新型有效的抗MTB治療方法。結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，機(jī)體能夠通過(guò)各種模式識(shí)別受體識(shí)別結(jié)核分枝桿菌組分，從而發(fā)揮抗感染免疫作用[4]。其中Toll樣受體（toll like receptor，TLR）2、TLR4和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization domain 2，NOD2）分別是細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體，在感染中發(fā)揮重要作用[5-7]。

機(jī)體的免疫調(diào)控是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，各信號(hào)通路之間往往存在相互作用與聯(lián)系[8]。NOD2主要表達(dá)于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，除了產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，還能夠通過(guò)NF-κB和MAPK途徑增加趨化因子的產(chǎn)生，從而使免疫細(xì)胞在機(jī)體抗感染中發(fā)揮重要作用[9]。當(dāng)微生物突破機(jī)體的皮膚、黏膜等物理屏障時(shí)，Toll樣受體可識(shí)別病原體并刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在菌體的刺激下，不同的TLRs將信號(hào)傳遞給下游分子，從而激活多種信號(hào)通路，其中之一就是通過(guò)激活NF-κB進(jìn)而表達(dá)炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，除了TLR3外，其余TLRs是通過(guò)活化髓樣分化因子88（MyD88）激活下游NF-κB和MAPK途徑，而NOD1、NOD2是通過(guò)募集活化RIP2蛋白激活NF-κB[9]，因此NOD2和TLRs在激活下游NF-κB途徑可能存在相互作用。目前研究中對(duì)肺組織NOD2與TLRs信號(hào)通路在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)存在怎樣的調(diào)控關(guān)系仍不清楚[11]。本文旨在探討NOD2-/-小鼠感染結(jié)核分枝桿菌H37Ra后Toll樣受體TLR2、TLR4的變化，為豐富結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)理及尋求臨床免疫治療或設(shè)計(jì)新型疫苗提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NOD2-/-小鼠由美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)院院士耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系Richard A.Flavell教授饋贈(zèng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)梁錦屏副教授，寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF條件下飼養(yǎng)繁殖，設(shè)立野生型小鼠C57BL/6為對(duì)照（WT）組。小鼠6～8周齡雄鼠，18～22 g，每只小鼠均剪取指甲提取DNA采用瓊脂糖凝膠電泳重復(fù)鑒定，確認(rèn)無(wú)誤后隨機(jī)分組。分籠前飼養(yǎng)3 d，自由攝取食水。

1.1.2 試劑TLR2、TLR4等兔抗鼠抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL（Enhanced chemiluminescent）化學(xué)發(fā)光液（Amersham，美國(guó)）；RNA提取試劑盒（天根生化科技公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）；ELISA試劑盒（酶聯(lián)生物科技有限公司）；PCR引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建NOD2敲除組和野生型組隨機(jī)分為生理鹽水組和H37Ra組，即生理鹽水滴注野生型小鼠組（wn）、H37Ra滴注野生型小鼠組（wh）、生理鹽水滴注NOD2-/-小鼠組（nn）、H37Ra滴注NOD2-/-小鼠組（nh），共4組，每組6只。腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，采用非暴露式氣管滴注30μL H37Ra菌液（1×106CFU），垂直懸掛1 min使菌液在肺臟內(nèi)均勻分布，建立感染模型小鼠，陰性對(duì)照組（wn、nn組）同法滴注30μL生理鹽水。造模1周后各組處死6只小鼠取材，8周后取各組剩余小鼠組織。

1.2.2 觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，無(wú)菌取肺臟，4%的多聚甲醛固定48 h，進(jìn)行脫水、包埋、切片并HE和抗酸染色。鏡檢觀察小鼠感染情況及肺臟病變程度。

1.2.3 肺組織中TLR2、TLR4基因表達(dá)情況 取小鼠肺組織，無(wú)菌無(wú)酶環(huán)境下提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表1 PCR實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá) 取小鼠肺組織，提總蛋白，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃，搖床孵育2 h。特異性抗體孵育（一抗稀釋比為1∶1000），4℃水平搖床過(guò)夜。次日1∶7000稀釋山羊抗兔二抗室溫孵育2 h，ECL底物顯色，蛋白成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD2-/-小鼠、野生型小鼠基因型鑒定

結(jié)果表明，1、2號(hào)小鼠為NOD2-/-小鼠；3、4號(hào)小鼠為野生型小鼠。見(jiàn)圖1。

圖1 PCR瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型

2.2 結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染對(duì)NOD2-/-小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

1周WT小鼠感染后肺組織中可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、多數(shù)肺泡腔消失，NOD2-/-小鼠感染組可見(jiàn)肺組織中有彌漫性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織實(shí)變，多數(shù)肺泡腔消失，高倍鏡下可見(jiàn)上皮樣細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的肉芽腫樣病變。8周各組與1周組病理特征相似，無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠肺組織病理切片HE染色（×200）

2.3 觀察結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染NOD2-/-小鼠后肺組織中結(jié)核分枝桿菌菌體

1周小鼠抗酸染色后，NOD2-/-與WT感染組見(jiàn)較少的結(jié)核病變結(jié)節(jié)，生理鹽水組未出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌體；8周NOD2-/-小鼠感染組肺組織內(nèi)出現(xiàn)MTB聚集成團(tuán)，NOD2-/-小鼠感染MTB后其炎癥病理較WT小鼠感染組更嚴(yán)重。見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠肺臟抗酸染色結(jié)果（×1000）

2.4 NOD2-/-小鼠感染結(jié)核分枝桿菌H37Ra后對(duì)TLR2、TLR4基因表達(dá)的影響

NOD2-/-小鼠與WT小鼠經(jīng)氣管滴入生理鹽水、H37Ra，提取肺組織RNA，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)兩組TLR2、TLR4基因的表達(dá)。8周NOD2-/-小鼠H37Ra感染組TLR2、TLR4表達(dá)均高于WT小鼠H37Ra感染組（P均<0.001）。1周與8周WT小鼠組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），8周NOD2-/-小鼠感染組TLR2、TLR4 mRNA均高于1周NOD2-/-小鼠感染組（P均<0.001）。見(jiàn)圖4。

圖4 NOD2-/-與WT小鼠肺組織中TLR2、TLR4基因表達(dá)

2.5 結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染NOD2-/-小鼠后肺組織中TLR2、TLR4蛋白表達(dá)量

經(jīng)Western blot對(duì)兩組小鼠肺組織中TLR2、TLR4蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，1周組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），8周NOD2-/-小鼠感染組TLR4、TLR2蛋白表達(dá)量比WT小鼠感染組升高（P<0.05），相比于NOD2-/-小鼠生理鹽水組，H37Ra感染組TLR2和TLR4蛋白活化增加（P<0.01）。8周WT小鼠H37Ra感染組高于WT小鼠生理鹽水組（P<0.01）。見(jiàn)圖5。

3 討論

TB的防治是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的工作，寧夏地區(qū)作為偏遠(yuǎn)地區(qū)甚至有增加的趨勢(shì)[12]?？菇Y(jié)核藥物不但有藥物毒副作用，而且有耐藥甚至耐多藥的MTB產(chǎn)生，近年來(lái)出現(xiàn)結(jié)核病和艾滋病的雙重感染也是結(jié)核病防治的難題，因此目前迫切需要尋找更多抗結(jié)核的方法[13]。

H37Ra菌株比H37Rv菌株毒力弱，相比卡介苗（BCG）更接近結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的結(jié)構(gòu)，免疫原性更高，作為動(dòng)物感染模型菌株更合適，能為設(shè)計(jì)新型疫苗提供基礎(chǔ)研究[14-15]。TLR2/4可通過(guò)MyD88依賴途徑，激活MyD88及相應(yīng)的下游效應(yīng)因子來(lái)磷酸化NF-κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB），從而活化NF-κB，啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮免疫作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NOD2缺陷的小鼠控制結(jié)核分枝桿菌的能力大大下降[16]，這說(shuō)明NOD2可能在天然抗結(jié)核免疫中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。NOD2與配體結(jié)合后，誘發(fā)一系列炎性因子的產(chǎn)生，從而起到抗感染免疫作用。研究表明，NF-κB可能是NOD受體和TLR在天然免疫中起協(xié)同作用的信號(hào)通路基礎(chǔ)[17]。雖然已清楚NOD2和TLR2活化后可激活NF-κB和AP-1信號(hào)通路，但是這兩個(gè)信號(hào)通路之間是否能相互影響，在抗感染時(shí)是否對(duì)彼此有調(diào)控作用還不清楚[18]。在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，TLRs的下游信號(hào)因子MyD88缺失時(shí)，BCG感染小鼠的NOD2受體可補(bǔ)充發(fā)揮免疫作用[19]。

圖5 NOD2-/-與WT小鼠不同處理后肺組織TLR2、TLR4蛋白表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)利用NOD2-/-小鼠模型，觀察在NOD2缺失的情況下TLR的表達(dá)，探討NOD樣受體（NOD-like receptor，NLR）和TLR相互調(diào)控，共同抗菌的機(jī)制?？顾峤Y(jié)果顯示，H37Ra感染小鼠1周后出現(xiàn)少量結(jié)核分枝桿菌菌體，而對(duì)照組未出現(xiàn)，8周差異更顯著，且NOD2缺陷小鼠感染組相對(duì)于野生小鼠組結(jié)核分枝桿菌菌體普遍增多，H37Ra可以有效感染小鼠。病理結(jié)果表明，1周和8周兩種小鼠感染組肺紋理增粗，間質(zhì)少量充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，但肺組織未見(jiàn)典型的干酪樣結(jié)核性壞死。這與張愛(ài)霞等[20]和夏長(zhǎng)勝[21]的研究結(jié)果不一致，認(rèn)為感染7 d后小鼠肺臟組織紋理清晰，間質(zhì)正常，未見(jiàn)明顯炎癥性損傷，分析是由于造模方式不同，上述研究采用尾靜脈注射；而Lai等[22]認(rèn)為在肺部感染減毒結(jié)核分枝桿菌（MTB H37Ra）的早期階段，肺部感染水平以對(duì)數(shù)方式增加，直至C57BL/6小鼠感染后第14天和第21天，這與本實(shí)驗(yàn)H37Ra感染小鼠8周抗酸結(jié)果一致。提取小鼠肺組織的RNA與蛋白，檢測(cè)TLR2和TLR4的表達(dá)，更準(zhǔn)確地體現(xiàn)H37Ra感染的NOD2-/-小鼠肺組織中TLR2、TLR4蛋白的作用。本研究發(fā)現(xiàn)H37Ra感染小鼠1周TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與基因檢測(cè)結(jié)果一致。處理8周WT小鼠相比于NS組，H37Ra感染組TLR2和TLR4的表達(dá)上升，這與Li等[23]的研究結(jié)果一致；NOD2-/-小鼠感染H37Ra后TLR2、TLR4蛋白表達(dá)較野生型小鼠升高。本研究結(jié)果表明，NOD2基因缺失時(shí)，H37Ra感染后的小鼠TLR2、TLR4基因表達(dá)升高，補(bǔ)充發(fā)揮抗感染免疫作用。有研究發(fā)現(xiàn)，雖然NOD2激活NFκB通路，但它抑制TLRs介導(dǎo)的NF-κB激活，因此NOD2缺失降低了這種抑制作用，使NF-κB增加[24]，而Wu等[25-26]認(rèn)為一些炎癥因子或者NF-κB的表達(dá)與TLR2/TLR4之間存在正反饋調(diào)節(jié)，因此本課題組將繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)通路的研究。

在其他疾病的研究中，已經(jīng)對(duì)這兩個(gè)信號(hào)的關(guān)系有一些定論。Khan等[9]研究表明NOD2和TLR4在激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）活性方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。因此，同時(shí)激活NOD2和TLR4可能具有顯著的免疫治療潛力，可增強(qiáng)DC的功能，提高對(duì)病原體的免疫力。Khan等[27]認(rèn)為NOD-2L和TLR-4L與減少劑量的異煙肼相結(jié)合，降低了肺部的MTB，這種模式識(shí)別受體和TB藥物的輔助治療可能具有足夠的潛力來(lái)減少結(jié)核病患者的治療劑量和持續(xù)時(shí)間，并且為結(jié)核病治療開(kāi)辟了新的途徑，包括免疫療法。而NOD2與TLR4的協(xié)同作用導(dǎo)致與疾病相關(guān)的大腦核團(tuán)活化增加，從而加強(qiáng)疾病和大腦對(duì)外周免疫刺激的反應(yīng)，NLR和TLR在免疫細(xì)胞水平上的已知相互作用延伸到影響大腦功能和行為的相互作用[28]。最新數(shù)據(jù)表明NOD2基因沉默在軟骨細(xì)胞中29 kDa氨基端纖維連接蛋白片段（29 kDa Fn-f）與TLR2表達(dá)下降，顯示NOD2參與29 kDa Fn-f誘導(dǎo)的TLR2表達(dá)[29]。但是關(guān)于TLR4、TLR2和NOD2在結(jié)核病中的抗菌機(jī)制還不完善，因此本研究具有創(chuàng)新性和必要性，課題組后續(xù)將繼續(xù)采用NOD2與TLR4激動(dòng)劑處理小鼠和相關(guān)免疫細(xì)胞進(jìn)行研究。