李夢琪，焦龍杏，郭嘉欣，尚 靜，徐遠義，黃允寧

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系，銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，銀川 750001）

胃癌是全球最常診斷的癌癥之一[1]。轉移是胃癌高病死率的主要原因，而腫瘤細胞發(fā)生上皮間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉移的分子機制之一[2]。目前胃癌的治療以手術和化療為主[3]，但效果并不理想。因此，開發(fā)有效的抗腫瘤藥物抑制人胃癌細胞的侵襲、遷移和EMT對胃癌的治療具有重要意義。硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）是一種帶有硫酸根的多糖，具有腹腔吸收緩慢，作用時間持久的特點。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該分子質量的DS可以抑制人胃癌細胞的增殖和粘附，并減少腹腔種植轉移[4]。然而，其發(fā)揮作用的分子機制還需進一步探究。高遷移率族蛋白AT2（HMGA2）是一種結構轉錄因子，屬于高遷移率族蛋白家族成員之一。據(jù)The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析HMGA2在腫瘤中高表達，并且在胃癌患者組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。有文獻[5-6]研究顯示，前列腺癌、食管鱗狀細胞癌中HMGA2與腫瘤細胞發(fā)生EMT密切相關。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵因子，研究表明，在視網(wǎng)膜母細胞瘤中microRNA-98通過介導Wnt/β-catenin途徑靶向HMGA2抑制視網(wǎng)膜細胞瘤的遷移和侵襲[7]。因此，探究以HMGA2/β-catenin為靶點的研究，對胃癌的治療具有積極的意義。本研究通過體內(nèi)外實驗，探討DS是否可以影響人胃癌細胞HMGA2/βcatenin的表達并抑制人胃癌細胞侵襲、遷移和EMT。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌標本 收集寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2018年10月至2019年10月經(jīng)手術切除、術后病理確診為胃腺癌的組織標本24例，所有患者術前均未接受放療及化學藥物治療。

1.1.2 細胞與動物 人胃癌細胞株HGC-27，由哈爾濱醫(yī)科大學肝脾外科實驗室蔣寒冰贈予。BALB/c裸鼠購自北京維通利華實驗動物科技有限公司［動物牌照號SCXX（Jing）2006-0009］，5～6周齡，雄性，體質量18～22 g。在寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心SPF條件下飼養(yǎng)，實驗步驟已通過寧夏醫(yī)科大學實驗動物福利倫理審查委員會批準。1.1.3藥物與試劑DS分子質量500000 Da，購自美國Sigma公司。HMGA2、β-catenin、E-cad單克隆一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；N-cad一抗購自中國博奧森公司；β-actin抗體、山羊抗兔和鼠二抗均購自中杉金橋技術有限公司；胎牛血清購自Bioind公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；兔二步法檢測試劑盒（PV-9001）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；電泳轉膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；反轉錄及實時熒光定量（RT-qPCR）試劑購自TaKaRa公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶公司；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS與1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 免疫組織化學 免疫組化染色采用二步法。標本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片烤干，二甲苯及梯度濃度的乙醇溶液脫蠟、脫水、抗原修復，封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，分化，脫水，封片。顯微鏡觀察陽性染色分布特點，選定具有代表性的5個視野拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，平均光密度值=陽性染色組織積分光密度（IOD）/面積（area）。

1.2.3 劃痕愈合實驗 將HGC-27細胞接種于6孔板，待細胞鋪滿孔底，用無菌移液器槍頭在6孔板底部進行“一”字形劃痕，PBS洗3次后對照組加入無血清培養(yǎng)基，DS組加入含0.3% DS的無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察0、24 h后細胞的愈合情況并拍照。沿劃痕邊緣取3處測量劃痕寬度，取平均值。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度－觀察時間劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4 Transwell實驗 采用預鋪Matrigel基質膠的8μm規(guī)格的聚碳酸酯濾膜培養(yǎng)小室，進行Transwell侵襲實驗；采用同樣規(guī)格未鋪基質膠的小室進行Transwell遷移實驗。將HGC-27細胞制成1×105/mL密度的細胞懸液，接種200μL細胞懸液到Transwell小室的上室，下室加入500μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，每組設3個復孔。在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕擦拭上室，4%多聚甲醛固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野的細胞數(shù)，取平均數(shù)為每組穿過小室的細胞數(shù)。

1.2.5 Western blot將0、12和24 h收集的細胞加入裂解液冰上裂解，用BCA蛋白定量試劑盒定量。等量蛋白（50μg）上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（6%～15%），常規(guī)濕轉法進行轉膜，10%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，對應抗體4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，二抗孵育室溫2 h，滴入ECL化學發(fā)光試劑，AmershamImager 600儀器曝光。應用ImageJ軟件測量各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，用各時間點目的蛋白與內(nèi)參蛋白表達灰度值的比值來表示相對蛋白量，用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行各時間點比較，Graphpadprism 8.0繪制柱狀圖。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）使用Trizol法提取細胞總RNA，檢測RNA濃度和純度，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒（RR047）說明將RNA逆轉錄成cDNA，然后用TBGreen法（TaKaRa，RR820）以GAPDH為內(nèi)參進行RTqPCR，引物序列見表1。每個樣本設3個復孔，記錄CT值，用2-△△CT方法計算基因的表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.7 構建裸鼠腹腔種植轉移模型BALB/c裸鼠在寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心SPF條件下飼養(yǎng)，可自由獲取無菌食品和水。24只隨機分為對照組、DS組（0.3% DS干預），每組12只，調(diào)整HGC-27細胞濃度為1×107個/mL，取0.2 mL細胞懸液注射于裸鼠腹腔。整個實驗過程嚴格按照無菌操作進行。術后第14天，采用脫頸法處死裸鼠，然后觀察腹腔內(nèi)特別是網(wǎng)膜內(nèi)腫瘤結節(jié)的數(shù)量、大小、顏色。收集大網(wǎng)膜組織經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水預滅菌處理，-80℃冷凍，用于后續(xù)實驗。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0和Graphpad prism 8.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析和作圖。各實驗獨立重復3次，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HMGA2、β-catenin、N-cad和E-cad在人胃癌組織中的表達

人胃癌組織免疫組化結果顯示，癌組織中HMGA2主要呈棕黃色分布于細胞核；β-catenin、N-cad在胃癌細胞胞漿呈棕黃色分布，而在癌旁正常組織中染色均弱于癌組織；E-cad呈棕黃色線性分布于癌旁正常組織的細胞膜，而癌組織染色減少。癌組織中HMGA2、β-catenin、N-cad表達均高于癌旁正常組織，而E-cad表達則低于正常組織（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 HMGA2、β-catenin、E-cad和N-cad在人胃癌組織中的表達

2.2 DS抑制人胃癌細胞的劃痕愈合能力

HGC-27細胞劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，DS干預24 h后HGC-27細胞的劃痕愈合能力受到抑制（P＜0.01），提示DS可以抑制胃癌細胞的遷移能力。見圖2。

圖2 劃痕愈合實驗觀察0和24 h光鏡下劃痕愈合能力

2.3 DS抑制人胃癌細胞HGC-27的遷移和侵襲

Transwell結果顯示，與對照組相比，DS干預24 h后HGC-27細胞遷移數(shù)量減少（P＜0.01），同樣在DS干預24 h后HGC-27細胞侵襲數(shù)量較對照組減少（P＜0.01），表明DS可以抑制HGC-27細胞的遷移和侵襲能力。見圖3A、B。

圖3 DS抑制人胃癌細胞HGC-27的遷移和侵襲

2.4 Western blot與RT-qPCR檢測人胃癌細胞HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表達

在DS干預人胃癌細胞第0 h DS組HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad蛋白表達與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），而12、24 h DS組HMGA2、β-catenin、N-cad蛋白水平均低于對照組（P均＜0.05）；E-cad的表達在12 h差異無統(tǒng)計學意義，但在24 h DS組蛋白表達高于對照組（P＜0.01）。見圖4A、B。DS干預24 h后提取總RNA進行RT-qPCR分析，與對照組相比，DS可以減少HMGA2、β-catenin、N-cad的表達（P＜0.05），而增加E-cad的表達（P＜0.01）。見圖4C。

圖4 DS干預HGC-27細胞后各因子蛋白和mRNA的表達

2.5 建立裸鼠腹腔種植轉移模型

通過腹腔種植轉移模型可觀察到裸鼠腹腔轉移腫瘤結節(jié)呈瓷白色，質地堅硬；對照組腫瘤結節(jié)數(shù)量明顯多于DS組，且腫瘤結節(jié)體積較DS組大。見圖5。

圖5 腹腔種植轉移模型觀察腹腔轉移瘤數(shù)量

2.6 Western blot檢測裸鼠大網(wǎng)膜組織HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表達

在裸鼠組織中DS干預后HMGA2、β-catenin、N-cad蛋白表達均低于對照組（P＜0.01），而Ecad在DS干預后表達高于對照組（P＜0.01）。見圖6A、B。

圖6 目的因子在裸鼠腹腔種植轉移瘤模型大網(wǎng)膜中蛋白表達水平

3 討論

胃癌是一種高患病率、高病死率的疾病。鑒于胃癌轉移是胃癌高病死率的主要原因之一，所以研究有效的抗腫瘤藥物抑制腫瘤轉移提高患者存活率具有重要意義。

DS屬于右旋糖苷的衍生物，其生物活性與其分子質量有關。有研究[8]表明，分子質量在1000 Da到10000 Da的DS可以抑制HIV病毒的活性。而分子質量在10000 Da到40000 Da時，DS可通過調(diào)節(jié)細胞表面的電荷減少細胞聚集，提高干細胞產(chǎn)量，并可以通過減少透明質酸酶的表達抑制乳腺癌細胞的遷移能力[9-10]。本課題組選用的DS分子質量為500000 Da，經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)該分子質量的DS可以抑制人胃癌細胞的增殖和粘附，并減少腹腔種植轉移[4]。然而，其發(fā)揮作用的分子機制還需進一步探究。

HMGA2是一種結構轉錄因子，屬于HMGA蛋白家族。HMGA蛋白的特征是含有3個DNA結合區(qū)域，稱為AT-hooks和一個酸性羧基末端，其可以通過與DNA中AT富集區(qū)域結合而改變DNA構象調(diào)控基因表達，從而影響包括細胞生長、增殖、分化和死亡在內(nèi)的一系列生物過程[11]。HMGA2在胚胎期以及不成熟組織中高度表達[12]，但在正常的成年組織中不表達或低表達，而研究顯示在視網(wǎng)膜母細胞瘤、肺癌、肝癌、結腸癌[7，13-15]中HMGA2均有過表達。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵因子，當上游因子激活Wnt信號通路后胞質內(nèi)β-catenin不能正常降解而富集轉運入細胞核，在胞核內(nèi)結合轉錄因子調(diào)節(jié)下游靶基因的表達[16]，然而Wnt信號通路是EMT的關鍵通路之一。HMGA2與Wnt信號通路關系密切，Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)microRNA-98通過介導Wnt/β-catenin途徑靶向HMGA2抑制視網(wǎng)膜細胞瘤的遷移和侵襲；Dai等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-150-5p通過靶向HMGA2調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來抑制非小細胞肺癌的轉移和復發(fā)。因此，在胃癌中HMGA2/β-cantenin可能成為治療靶點。

EMT在胚胎形成和發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[18]，而在腫瘤發(fā)展過程中EMT作為關鍵步驟參與腫瘤的轉移[19]。腫瘤在體內(nèi)轉移過程分為：腫瘤細胞從腫瘤原發(fā)灶分離并發(fā)生遷移，穿透基底膜，進入血液或淋巴管，從血液或淋巴管流出，最后形成轉移性結節(jié)[20]。然而，EMT在腫瘤轉移起始階段，通過增強腫瘤細胞的流動性、侵襲性和對凋亡刺激的抵抗力促使腫瘤細胞離開原發(fā)灶開始尋找原發(fā)灶以外適合生存的器官，即腫瘤發(fā)生轉移[21]。因此，EMT被認為是腫瘤發(fā)生的關鍵標志，而研究通過抑制EMT治療腫瘤可以作為腫瘤治療的新策略[22]。腫瘤細胞發(fā)生EMT的同時會伴隨細胞內(nèi)的分子改變，例如，上皮標記物（E-cad）表達減少，間質標記物（N-cad、vimentin）表達增加，這些標志性的分子改變會有助于判斷EMT發(fā)生與否。Liu等[23]研究證明Tiam1通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導細胞發(fā)生EMT，促進甲狀腺癌轉移。

本研究對24例胃癌標本進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：癌組織中HMGA2、β-cantenin、N-cad表達明顯高于癌旁正常組織；而癌組織中E-cad表達明顯弱于正常組織。推測在胃癌中HMGA2、Wnt信號通路與EMT之間是否存在聯(lián)系，DS是否可以影響這一過程。為驗證猜想進行了體外實驗的研究，劃痕愈合實驗結果顯示DS干預24 h后細胞的遷移能力減弱，表明DS可抑制人胃癌細胞的橫向遷移能力。Transwell實驗顯示DS干預24 h后發(fā)生侵襲和遷移的細胞數(shù)量明顯減少，證明DS可抑制人胃癌細胞的遷移和侵襲能力。為進一步探討DS作用的分子機制，選取HGC-27細胞進行Western blot和RT-qPCR實驗，結果顯示DS干預24 h后HMGA2、β-cantenin、N-cad的表達與對照組相比明顯減弱，而E-cad表達顯著增強。以上體外研究結果顯示：DS可以抑制人胃癌細胞的侵襲和遷移，并使HMGA2、β-cantenin、N-cad表達減弱，而E-cad表達增強。為了繼續(xù)探索DS的作用機制，本研究進行體內(nèi)實驗：在已建立裸鼠腹腔種植轉移模型中可以觀察到對照組裸鼠腹腔轉移腫瘤結節(jié)呈瓷白色，質地堅硬；并且對照組腫瘤結節(jié)數(shù)量多于DS組，且腫瘤結節(jié)體積較DS組大。取DS組與對照組裸鼠的大網(wǎng)膜組織進行Western blot檢測HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表達情況，結果表明DS組經(jīng)過DS干預后HMGA2、β-cantenin、N-cad的表達明顯受到抑制，但是DS促進了E-cad的表達，此結果與體外Western blot實驗結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)DS可以抑制HMGA2/β-catenin，并且影響人胃癌細胞侵襲、遷移和EMT，提示HMGA2/β-catenin可能是DS發(fā)揮抑制腫瘤轉移作用的新靶點。

綜上所述，DS可以下調(diào)HMGA2/β-cantenin信號抑制人胃癌細胞侵襲、遷移和EMT。其中的具體機制還需要進一步驗證，同時本研究為后續(xù)探究DS抑制腫瘤轉移的分子機制提供新的思路。