周華朝，張 武

(棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院 外三科,山東 棗莊277100)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性炎性自身免疫性疾病，主要為軸骨骼和骶髂關(guān)節(jié)炎癥癥狀，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能受損。全球人群中AS的患病率為0.7%-3.2%，男性患者的數(shù)量約為女性患者的2倍[1-2]。目前，盡管尚不清楚AS的發(fā)生機(jī)理，但可以確定其具有遺傳易感性，先天免疫方面與環(huán)境因素相結(jié)合被認(rèn)為在AS的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。miRNA在AS疾病中的功能也有研究報(bào)道[3-4]，但是miR-4319在AS中的功能尚未十分清楚。腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3(TNFα-inducible protein 3 antibody，TNFAIP3)是核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(nuclear transcription factor kappaB，NF-κB)NF-κB信號傳導(dǎo)的內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)劑，已在多種自身免疫和炎性疾病中被廣泛描述，如慢性肺炎[5]。本研究旨在探究miR-4319在AS成纖維細(xì)胞成骨分化中的功能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

組織標(biāo)本來自棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院外科需要進(jìn)行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的AS患者6例，外傷導(dǎo)致股骨脛骨骨折需做髖骨置換術(shù)的非自身免疫疾病的患者6例?；颊呒凹覍倬炗兄橥鈺?。杜氏細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)購自Gibco；青鏈霉素雙抗混合液購自Hyclone；胎牛血清購自杭州四季青公司；Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒購自美國Millipore；RNA下拉試劑盒(pull-down)、生物素3′末端標(biāo)記試劑盒(pierce RNA 3′ end biotinylation kit)購自Thermo；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒購自Promega；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒、羥脯氨酸檢測試劑盒、放免法骨鈣素檢測試劑盒均購自南京建成生物工程公司；所涉及的質(zhì)粒構(gòu)建、引物設(shè)計(jì)合成均送至上海吉瑪公司完成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分離培養(yǎng)

按照馮仲鍇等[6]的方法分離培養(yǎng)AS成纖維細(xì)胞。

1.2.2分組處理

將培養(yǎng)的AS成纖維細(xì)胞、正常成纖維細(xì)胞分別標(biāo)記為AS成纖維細(xì)胞組、正常成纖維細(xì)胞組。將AS成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-TNFAIP3組(轉(zhuǎn)染pcDNA-TNFAIP3)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-4319組(轉(zhuǎn)染miR-4319 mimics)、miR-4319+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-4319 mimics和pcDNA)、miR-4319+pcDNA-TNFAIP3組(共轉(zhuǎn)染miR-4319 mimics和pcDNA-TNFAIP3)。具體的處理方法為：將脂質(zhì)體與質(zhì)?；駾NA按照脂質(zhì)體與質(zhì)粒或DNA之比為3∶1的量混合均勻，然后加入AS成纖維細(xì)胞中培養(yǎng)5 h，再補(bǔ)充新培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用RT-qPCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

將等待檢測的細(xì)胞提取總RNA并合成cDNA，作為模板。用RT-qPCR試劑盒檢測細(xì)胞中miR-4319、TNFAIP3的表達(dá)。結(jié)果以U6、GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-4319、TNFAIP3的表達(dá)水平。miR-4319，上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG-ACGTGGCT-3′，下游引物 5′-CACCCAGAGCAAAGCCAC-3′；U6，上游引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH，上游引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；TNFAIP3的引物由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn)

將等待檢測的細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，提取總蛋白進(jìn)行定量和變性處理。取變性后的蛋白用于蛋白電泳。電泳時先進(jìn)行穩(wěn)壓電泳，再進(jìn)行溫流電泳。結(jié)束后將蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，結(jié)束后將膜進(jìn)行5%脫脂奶粉的封閉處理，然后再將膜浸入一抗(多克隆抗體TNFAIP3，1∶1 000)溶液中，4℃孵育過夜。第2天，將膜轉(zhuǎn)移至二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，1∶2 000)溶液中，37℃孵育2 h。結(jié)束后，將膜進(jìn)行顯影、曝光。

1.2.5生物信息學(xué)預(yù)測

通過生物信息學(xué)在線預(yù)測網(wǎng)站targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測到miR-4319 與TNFAIP3之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

首先，根據(jù)預(yù)測到的TNFAIP3結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含有TNFAIP3結(jié)合位點(diǎn)(WT-TNFAIP3)和不含有結(jié)合位點(diǎn)的突變序列(MUT-TNFAIP3)，并將其克隆至熒光載體，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒。將載體質(zhì)粒分別與miR-NC、miR-4319共轉(zhuǎn)染至AS成纖維細(xì)胞。用雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測細(xì)胞中熒光蟲熒光素酶的活性和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果用二者的比值表示細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.7RIP實(shí)驗(yàn)

通過Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)分析。集體操作為：收集培養(yǎng)的AS成纖維細(xì)胞并將其用RIP裂解緩沖液重懸，并將其與含有抗Ago2抗體或IgG抗體綴合的磁珠在4℃孵育過夜。次日，洗滌3次后，將磁珠與蛋白酶K一起溫育。隨后提取其中的總RNA并合成cDNA，通過RT-qPCR分析確定TNFAIP3的相對表達(dá)。

1.2.8RNA pull-down實(shí)驗(yàn)

先用pierce RNA 3′ end biotinylation kit標(biāo)記生物素NC和生物素miR-4319。用RNA pull-down試劑盒操作，將生物素標(biāo)記物與準(zhǔn)備好的磁珠在4℃條件下孵育過夜。次日3 000 rpm/min離心，棄上清，緩緩加入RIP洗滌液。再向磁珠RNA混合物中加入細(xì)胞裂解液，低速離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。檢測分析TNFAIP3的富集情況。

1.2.9骨向分化標(biāo)記物ALP、膠原、骨鈣素含量檢測

ALP火星的檢測：使用ALP活性檢測試劑盒檢測。首先，收集等待檢測的細(xì)胞，充分裂解，然后按照試劑盒說明書要求操作和結(jié)果判定分析要求分析，檢測結(jié)果。ALP活性(U/L)為(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)×總體積反應(yīng)×1000/總體積樣本×18.5。

膠原含量檢測：采用羥脯氨酸比色法檢測待檢測細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中Ⅰ膠原的含量。

骨鈣素含量檢測：采用125I放免法檢測待檢測細(xì)胞的培養(yǎng)上清中骨鈣素的含量。

1.2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)所涉及的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式計(jì)量，用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-4319、TNFAIP3在AS成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)果如表1和圖1所示，與正常成纖維細(xì)胞相比，AS成纖維細(xì)胞中miR-4319表達(dá)顯著升高，TNFAIP3的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

圖1 TNFAIP3的蛋白表達(dá)圖

表1 miR-4319、TNFAIP3在AS成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-4319靶向TNFAIP3

生物信息在線預(yù)測結(jié)果顯示，miR-4319與TNFAIP3之間存在連續(xù)7個互補(bǔ)的核苷酸序列(圖2)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，與miR-NC組相比，miR-4319組WT-TNFAIP3細(xì)胞的熒光活性顯著降低；RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表3，與miR-NC組相比，miR-4319組Ago2-TNFAIP3/GAPDH的表達(dá)顯著升高；Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，與生物素NC探針組相比，生物素TNFAIP3探針組相關(guān)miR-4319富集顯著升高(P<0.05)。

圖2 核苷酸結(jié)合位點(diǎn)

表2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 過表達(dá)TNFAIP3對AS成纖維細(xì)胞成骨分化的影響

結(jié)果如表5所示，與pcDNA組相比，pcDNA-TNFAIP3組AS成纖維細(xì)胞中TNFAIP3的含量顯著升高，ALP、膠原、骨鈣素的含量均顯著升高(P<0.05)。

表5 過表達(dá)TNFAIP3的AS成纖維細(xì)胞的成骨分化

2.4 過表達(dá)miR-4319對AS成纖維細(xì)胞成骨分化的影響

結(jié)果如表6所示，與miR-NC組相比，miR-4319組細(xì)胞中miR-4319表達(dá)顯著升高，ALP、膠原、骨鈣素的含量均明顯下調(diào)(P<0.05)。

表6 過表達(dá)miR-4319的AS成纖維細(xì)胞的成骨分化

2.5 敲減TNFAIP3部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-4319對AS成纖維細(xì)胞成骨分化的調(diào)控

結(jié)果如表7所示，與miR-4319+pcDNA組相比，miR-4319+pcDNA-TNFAIP3組細(xì)胞中miR-4319表達(dá)顯著降低，ALP、膠原、骨鈣素的含量均發(fā)生明顯上升(P<0.05)。

表7 敲減TNFAIP3部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-4319對AS成纖維細(xì)胞成骨分化的影響

3 討論

到目前為止，對于AS的早期診斷和治療，尚未找到合適的方法。microRNA(miRNAs)是一種內(nèi)源性的小的非編碼RNA，控制著靶基因和細(xì)胞生物過程的功能，以穩(wěn)定的形式存在于人的血漿中，并可能作為疾病活動、發(fā)病機(jī)制和預(yù)后的生物標(biāo)志物[7]。Marzena等[8]報(bào)道，在AS中miRNA-5196在TNF-α治療之前的表達(dá)顯著高于抗TNF-α治療或者健康者，為AS的診斷和抗TNF-α患者的判斷提供依據(jù)。Wang等[9]報(bào)道，在AS患者的T細(xì)胞中，miR-199a-5p和自噬相關(guān)基因LC3、beclin1和ATG5的表達(dá)明顯降低，miR-199a-5p表達(dá)水平也與AS患者的強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動評分呈顯著的負(fù)相關(guān)，過表達(dá)miR-199a-5p后能夠促進(jìn)自噬相關(guān)基因的表達(dá)并抑制致炎因子的分泌，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與miR-199a-5p靶向腦內(nèi)富集Ras同系物(Ras homolog enriched in brain，Rheb)抑制雷帕霉素(rapamycin，mTOR)信號通路有關(guān)。Tetsuya等[10]在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的研究提示，miR-4319在正常軟骨細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)，但是其在骨關(guān)節(jié)炎中的功能未曾進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-4319在AS成纖維細(xì)胞中的表達(dá)異常升高，這是首次發(fā)現(xiàn)該miRNA在AS中失調(diào)。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-4319能夠抑制AS成纖維細(xì)胞的成骨分化，這揭示了miR-4319在AS中抑制AS成纖維細(xì)胞骨向分化的功能，為探索miR-4319在AS中的其他功能奠定基礎(chǔ)。深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-4319可靶向TNFAIP3，這也許與miR-4319在AS中的抑制AS成纖維細(xì)胞骨向分化的功能有聯(lián)系。

TNFAIP3利用泛素相關(guān)的功能來調(diào)節(jié)免疫激活，其缺乏與自身免疫性疾病高度相關(guān)[11-12]。Yang等[13]報(bào)道，TNFAIP3 rs10499194的基因多態(tài)性與AS風(fēng)險(xiǎn)的降低具有緊密的相關(guān)性。Ran等[14]在AS的研究中運(yùn)用微陣列分析發(fā)現(xiàn)，TNFAIP3在AS患者樣品組織中的表達(dá)不足，這對AS患者的診斷、預(yù)測具有指導(dǎo)意義。Zhai等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，TNFAIP3在AS患者外周血非單核細(xì)胞中的表達(dá)異常降低，沉默TNFAIP3后可促進(jìn)單核細(xì)胞炎癥的形成，并誘導(dǎo)自噬，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在AS成纖維細(xì)胞中TNFAIP3的表達(dá)異常降低，這與前輩的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，再次證明了TNFAIP3在AS中的表達(dá)缺失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TNFAIP3的AS成纖維細(xì)胞中成骨分化標(biāo)志物ALP、膠原、骨鈣素的含量異常上升，促進(jìn)AS成纖維細(xì)胞的成骨分化。這暗示TNFAIP3低表達(dá)對AS成纖維細(xì)胞的成骨分化具有抑制功能。