于士昌，張璐芳，翟建賓，譚國良，李國雷，趙 亮

(1.河北省中醫(yī)院 心胸外科，河北 石家莊050000;2.河北省衛(wèi)生健康委員會綜合監(jiān)督服務(wù)中心 中醫(yī)藥衛(wèi)生處，河北 石家莊050000；3.河北省中醫(yī)院 外三科，河北 石家莊050000)

失血性休克是臨床常見危重癥，是臨床中最為常見的死亡原因之一。既往研究表明，失血性休克隨復(fù)蘇時間的延長增加機體器官損傷程度，而在發(fā)生交通意外、自然災(zāi)害時，多數(shù)患者在休克早期不能及時復(fù)蘇，導(dǎo)致救治難度大大增加[1-2]。機體在復(fù)蘇期間，腸黏膜血管存在持續(xù)低灌流和收縮現(xiàn)象，最易導(dǎo)致腸道屏障作用消失，細(xì)菌異位，從而造成其他臟器繼發(fā)性損傷[3]。體外膜肺(ECMO)是目前危重癥患者救治的重要支持技術(shù)，既往研究證實[4-5]，ECMO技術(shù)可有效提高延遲復(fù)蘇失血性休克兔的復(fù)蘇成功率，改善休克再灌注后臟器損傷，但其對腸黏膜的影響及調(diào)控機制報道較少。為此，本研究通過建立延遲復(fù)蘇失血性休克兔模型，并在常規(guī)復(fù)蘇基礎(chǔ)上引入ECMO技術(shù)，進一步觀察ECMO對延遲復(fù)蘇失血性休克兔腸損傷的影響及可能調(diào)控機制，為臨床中延遲復(fù)蘇失血性休克患者的救治提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

MP100型生理記錄儀(美國Biopac公司)，三通接頭(德國B.Brown公司)，動物膜肺(西安西京醫(yī)療用品有限公司)，HD325C型生物切片機(湖北醫(yī)療器械七廠)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 試藥

乳酸鈉林格注射液(華仁藥業(yè)股份有限公司)，白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，大鼠抗兔Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB p65(NF-κB p65)、claudin、閉鎖蛋白(occludin)多抗(一抗，武漢博士德生物工程有限公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 實驗動物

50只雄性新西蘭大白兔，7月齡，體質(zhì)量2.0-3 kg，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[SYXK(渝)2017-0002]。單籠飼養(yǎng)，所有動物實驗符合3R原則，實驗過程遵循國家實驗動物管理條例及國家實驗動物管理實施細(xì)則。

1.4 延遲復(fù)蘇兔模型建立及分組

50只新西蘭大白兔禁食禁水12 h，隨機留取10只為對照組，其余40只采用股動脈放血法制備延遲復(fù)蘇兔模型[6]：經(jīng)耳源靜脈注射30 mg/kg的3%戊巴比妥那麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，雙側(cè)腹股溝備皮、鋪巾，剪開雙側(cè)股動脈皮膚，分離雙側(cè)股動脈后，用20號靜脈穿刺針穿刺并固定穿刺針，右側(cè)連接三通管用于放血和采血，并連接生理記錄儀監(jiān)測平均動脈壓(MAP)，左側(cè)進行輸血和補液。以1 mL/kg·min速度從左側(cè)股動脈放血，全血用肝素鈉抗凝備用，MAP下降至40 mmHg時停止，輸血或放血使MAP維持在35-40 mmHg，180 min后，36只存活兔隨機分組：休克組、常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組和ECMO+TLR激動劑組，每組9只，對照組未進行放血，其余操作同前。

1.5 復(fù)蘇方法

對照組和休克組：不進行任何復(fù)蘇處理；常規(guī)復(fù)蘇組：180 min后立即經(jīng)頸靜脈回輸全血及兩倍放血量的乳酸鈉林格液進行常規(guī)復(fù)蘇；ECMO復(fù)蘇組：150 min時行頸靜脈插管建立ECMO循環(huán)，180 min時進行常規(guī)復(fù)蘇的同時進行ECMO轉(zhuǎn)流復(fù)蘇，60 min后停止復(fù)蘇；ECMO+TLR激動劑組：150 min時行頸靜脈插管建立ECMO循環(huán)，180 min時進行常規(guī)復(fù)蘇的同時進行ECMO轉(zhuǎn)流復(fù)蘇，并經(jīng)頸靜脈注射5 mg/kg的LPS(溶于生理鹽水)，60 min后停止復(fù)蘇。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1腸道屏障功能檢測

復(fù)蘇完畢，各組經(jīng)右側(cè)股動脈采血，靜置分層后，4℃預(yù)冷離心機離心收集上層血清，采用分光光度計法測定血清二胺氧化酶(DAO)水平，用酶標(biāo)儀檢測436 nm波長處光密度(A)值。空氣栓塞法處死各組兔，立即解剖，無菌獲取腸系膜淋巴結(jié)、腹腔灌洗液、肝臟、腎臟、肺臟，放入細(xì)菌培養(yǎng)液，需氧條件下培養(yǎng)24 h，無氧條件下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為35℃，獲得陽性標(biāo)本進行涂片鑒定，有大腸桿菌或類桿菌則記為陽性，以細(xì)菌培養(yǎng)陽性器官數(shù)占總培養(yǎng)器官數(shù)比例為細(xì)菌異位率[7]，即陽性器官數(shù)/(兔數(shù)×5)。

1.6.2回腸組織病理學(xué)觀察

復(fù)蘇畢，取各組距離盲腸5 cm處的回腸組織，用生理鹽水輕輕沖洗表面，部分置于10%中性甲醛固定48 h，經(jīng)酒精脫水、石蠟包埋后，制作厚度為4 μm的連續(xù)切片，每只兔回腸組織取5張切片，進行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察回腸黏膜組織病理學(xué)變化。

1.6.3回腸組織中IL-6、TNF-α水平檢測

剖腹取部分新鮮回腸組織，用PBS輕輕沖洗表面，加入1 mL PBS，勻漿后2500 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，收集上清液采用ELISA試劑盒檢測回腸組織中IL-6、TNF-α水平，嚴(yán)格參照試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測492 nm波長處A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測炎癥因子水平。

1.6.4回腸組織中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin mRNA表達(dá)檢測

新鮮回腸組織用組織剪剪碎，采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得互補鏈cDNA，以之為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)，按照試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性25 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，共42個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，以2-△△CT計算目的基因的相對表達(dá)強度。引物序列：TLR4：F:5′-CTGATGCTGATGCTGATGC-3′，R:5′-GTGATGCTAGCTGACGTA-3′;NF-κB p65:F:5′-ACTGATGCTCGTACTGATG-3′,R:5′-GAATGCTGCCTGATGCTCC-3′;claudin:F:5′-ACCTTGAAACTGATGCCG-3′,R:5′-GTGATGCCTGATGCTGAC-3′;occludin:F:5′-ATGATGCTGATGCTGACCACG-3′,R:5′-TAGCTGATGCTGATGCAGTCC-3′;β-actin:F:5′-TAGCGTGACTGTAGCTGAT-3′,R:5′-GTAGTAGCTCTGATGCTGA-3′。

1.6.5回腸組織中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin蛋白表達(dá)檢測

將新鮮回腸組織放入液氮中研磨，加入細(xì)胞裂解液，于冰上裂解20 min，12 000 r/min離心10 min(離心半徑12 cm)取上清液，BCA法進行蛋白定量，取待測蛋白與等量上樣緩沖液混勻，于沸水中水浴10 min，再次離心取上清液，進行SDS-PAGE分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)、封閉后，加入稀釋一抗[TLR4、NF-κB p65(1∶500)，claudin、occludin(1∶400)]，4 ℃孵育過夜，加入稀釋二抗(1∶5 000)，常溫孵育1.5 h，電化學(xué)發(fā)光法進行顯影，用凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image J圖像處理軟件分析灰度值，待測蛋白相對表達(dá)量以條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組回腸粘膜組織病理學(xué)改變

對照組腸黏膜形態(tài)無明顯異常，休克組腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，絨毛大量脫落，大量炎性細(xì)胞浸潤及上皮細(xì)胞壞死；常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO組腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常，ECMO組病變更輕，但仍可見部分炎性細(xì)胞浸潤和上皮細(xì)胞水腫；ECMO+TLR4激動劑組較ECMO組病變加重，但較休克組輕，見圖1。

圖1 回腸黏膜組織病理學(xué)改變(HE×400)

2.2 各組腸道屏障功能比較與對照組比較，休克組血清DAO、細(xì)菌異位率較高(P<0.05)；與休克組比較，常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組及ECMO+TLR激動劑組血清DAO、細(xì)菌異位率均降低，其中ECMO復(fù)蘇組低于常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO+TLR激動劑組，常規(guī)復(fù)蘇組低于ECMO+TLR激動劑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組腸道屏障功能比較

2.3 各組回腸組織中炎癥因子水平比較

與對照組比較，休克組回腸組織中IL-6、TNF-α水平較高(P<0.05)；與休克組比較，常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組及ECMO+TLR激動劑組IL-6、TNF-α水平均降低，其中ECMO復(fù)蘇組低于常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO+TLR激動劑組，常規(guī)復(fù)蘇組低于ECMO+TLR激動劑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組回腸組織中炎癥因子水平比較

2.4 各組回腸組織中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin mRNA表達(dá)水平比較

與對照組比較，休克組TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量較高，claudin、occludin mRNA相對表達(dá)量較低(P<0.05)；與休克組比較，常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組及ECMO+TLR激動劑組TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量降低，其中ECMO復(fù)蘇組低于常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO+TLR激動劑組，常規(guī)復(fù)蘇組低于ECMO+TLR激動劑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與休克組比較，常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組及ECMO+TLR激動劑組claudin、occludin mRNA相對表達(dá)量升高，其中ECMO復(fù)蘇組高于常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO+TLR激動劑組，常規(guī)復(fù)蘇組高于ECMO+TLR激動劑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組回腸組織中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin mRNA相對表達(dá)量比較

2.5 各組回腸組織中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比較，休克組TLR4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量較高，claudin、occludin蛋白相對表達(dá)量較低(P<0.05)；與休克組比較，常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組及ECMO+TLR激動劑組TLR4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量降低，其中ECMO復(fù)蘇組低于常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO+TLR激動劑組，常規(guī)復(fù)蘇組低于ECMO+TLR激動劑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與休克組比較，常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組及ECMO+TLR激動劑組claudin、occludin蛋白相對表達(dá)量升高，其中ECMO復(fù)蘇組高于常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO+TLR激動劑組，常規(guī)復(fù)蘇組高于ECMO+TLR激動劑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05；與休克組比較，#P<0.05；與常規(guī)復(fù)蘇組比較，△P<0.05；與ECMO復(fù)蘇組比較，▲P<0.05。

3 討論

自然災(zāi)害、交通意外、戰(zhàn)爭等是導(dǎo)致失血性休克的重要原因，由于交通或醫(yī)療條件的限制，休克患者很難獲得早期復(fù)蘇，導(dǎo)致復(fù)蘇延遲，增加救治難度。既往研究顯示，失血性休克延遲復(fù)蘇可導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)加劇，且復(fù)蘇時進一步造成臟器缺血再灌注損傷，導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生率升高[8-9]。失血性休克復(fù)蘇后機體血壓、心率等指標(biāo)雖然已恢復(fù)，但為保證心臟、腦等重要臟器血流供應(yīng)，腸道等器官血流反而出現(xiàn)進一步下降，繼而引起多臟器繼發(fā)性損傷[10]。探討失血性休克延遲復(fù)蘇期間小腸結(jié)構(gòu)和功能損傷，并明確調(diào)控機制，對救治失血性休克延遲復(fù)蘇患者尤為重要。

小腸失血再灌注后，分布于腸絨毛頂端的上皮細(xì)胞最先受損，腸道完整性和屏障功能發(fā)生障礙[11]。DAO是分布與小腸上層絨毛中的一種酶，DAO血清水平升高提示腸道屏障功能受損，當(dāng)腸道屏障功能消失時，可導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌移位，引起腸源性感染，進一步增加腸源性促炎因子的釋放[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，休克組腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，絨毛大量脫落，大量炎性細(xì)胞浸潤及上皮細(xì)胞壞死，常規(guī)復(fù)蘇組和ECMO組腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常，ECMO組病變更輕；常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組血清DAO、細(xì)菌異位率及回腸組織中IL-6、TNF-α水平均低于休克組，且ECMO復(fù)蘇組低于常規(guī)復(fù)蘇組，提示ECMO可有效減輕失血性休克兔延遲復(fù)蘇后腸損傷，改善腸黏膜屏障功能。

TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白，可通過直接或間接與病原體結(jié)合，觸發(fā)機體天然防御系統(tǒng)[14]。細(xì)菌外膜蛋白進入機體后與細(xì)胞膜上受體結(jié)合形成復(fù)合物，TLR4激活，進而激活下游NF-κB p65進入細(xì)胞核，調(diào)控炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，進而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[15-16]。既往研究表明[17]，TLR4/NF-κB炎性軸與腸損傷后細(xì)菌異位關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)復(fù)蘇組、ECMO復(fù)蘇組回腸組織中TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白相對表達(dá)量低于休克組，且ECMO復(fù)蘇組低于常規(guī)復(fù)蘇組，緊密連接蛋白claudin、occludin表達(dá)與上述結(jié)果相反，提示在常規(guī)復(fù)蘇基礎(chǔ)上引入ECMO技術(shù)可能通過抑制TLR4/NF-κB炎性軸，上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)發(fā)揮改善腸道黏膜屏障功能。此外，本研究在ECMO復(fù)蘇組基礎(chǔ)上應(yīng)用TLR4通路激活劑LPS干預(yù)，結(jié)果顯示ECMO+TLR激動劑組血清DAO、細(xì)菌異位率、TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白相對表達(dá)量高于ECMO組，claudin、occludin mRNA和蛋白相對表達(dá)量低于ECMO組，進一步支持ECMO復(fù)蘇可通過TLR4/NF-κB炎性軸發(fā)揮減輕失血性休克兔延遲復(fù)蘇后腸損傷的作用。

綜上所述，在常規(guī)復(fù)蘇基礎(chǔ)上引入ECMO技術(shù)可有效減輕失血性休克兔延遲復(fù)蘇后腸損傷，可能通過TLR4/NF-κB炎性軸發(fā)揮改善腸道屏障功能，進而減輕延遲復(fù)蘇后的腸損傷，為臨床失血性休克延遲復(fù)蘇患者的救治提供治療策略及理論基礎(chǔ)。在進一步的研究中應(yīng)延長復(fù)蘇后觀察時間，以探討ECMO支持對失血性休克延遲復(fù)蘇預(yù)后的影響。