劉玉俠，齊 紅，段北野，付 堯，夏 莉，于 鴻，王 斌*

(1.吉林省腫瘤防治研究所,吉林 長春130012;2.吉林省腫瘤醫(yī)院；3.吉林省人民醫(yī)院)

胃癌是消化道惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率和死亡率均較高[1-2]。目前胃癌的治療還是以手術(shù)為主，輔以術(shù)后化療及靶向治療。在化療過程中，很多人會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，從而影響治療效果。為了探求腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制以及為耐藥腫瘤治療的研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，本?shí)驗(yàn)采用順鉑反復(fù)沖擊的方法建立人胃癌細(xì)胞SGC-7901耐藥細(xì)胞模型，為研究化療耐藥機(jī)制及治療等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材IMDM培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，Hyclon產(chǎn)品;MTT(噻唑藍(lán))，Sigma產(chǎn)品；胎牛血清，天津TB公司；DMSO(二甲基亞砜)，Sigma產(chǎn)品；順鉑，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；瓊脂糖，DNA標(biāo)準(zhǔn)品，寶泰克公司產(chǎn)品；低溫低速離心機(jī)，SORVALL RTT USA；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Labsystems Dragon；電泳儀,上海天能。

1.2人胃癌細(xì)胞株SGC-7901,吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 將液氮凍存的SGC-7901細(xì)胞取出復(fù)蘇后，離心洗滌，加入含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3.2誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞耐藥 SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期，加入終濃度為50 μmol/L順鉑，沖擊1 h后棄去含順鉑培養(yǎng)基，更換為新鮮配制的含10%FCS的DMDM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞長滿時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。傳代后細(xì)胞長滿瓶底時(shí)用同樣濃度的順鉑同樣方法沖擊.如此反復(fù)，體外連續(xù)培養(yǎng)、沖擊、傳代，并反復(fù)凍存，復(fù)蘇，觀察細(xì)胞株生長穩(wěn)定性，同時(shí)進(jìn)行抗藥性檢測(cè)。

1.3.3細(xì)胞抗藥性(抑制率)檢測(cè) 用MTT法將培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和經(jīng)過順鉑沖擊處理4次和6次的SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，0.25%胰酶消化后，洗滌、計(jì)數(shù)、重懸于10%FCS的DMDM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，加入96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，37℃,5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入順鉑，終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(等體積的生理鹽水)和空白對(duì)照(無細(xì)胞)。各組設(shè)6復(fù)孔。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT(5 mg/mL)，20 μL/孔待培養(yǎng)結(jié)束，小心吸棄培養(yǎng)上清，每孔加入DMSO，150 μL，震蕩溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A)，波長為492 nm。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算耐藥性(抑制率)及IC50(50%細(xì)胞生長抑制所需的藥物濃度)，計(jì)算方法：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組均值/陰性對(duì)照組均值)]×100%，應(yīng)用SPSS17.0軟件計(jì)算。

1.3.4SGC-7901細(xì)胞(對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組)DNA提取 見參考文獻(xiàn)[3]。

1.3.5SGC-7901細(xì)胞(對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組)多藥耐藥基因(MDR)及特異性基因片段擴(kuò)增及檢測(cè) (1)MDR基因全長擴(kuò)增、檢測(cè)：取1.3.4提取的DNA，采用PCR擴(kuò)增、瓊脂糖電泳法檢測(cè)MDR全長序列(約4.7 kb)的表達(dá)。引物設(shè)計(jì)：上游引物 ATGGATCTTGAAGGGGACCGCAATGGAGG，下游引物CATCTCATACAGTCAGAGTTCACTGGCGC。擴(kuò)增方法和條件：在離心管內(nèi)加入下列物質(zhì)：10x bf，2.5 μL；MgCl2，2.5 μL；DNTP(2 mM)，1.0 μL；Primers，1.0 μL(each)；DDW，16.0 μL；Target，1.0 μL；95℃,5 min；Tag，0.5 μL；94℃，60 s；55℃，80 s；72℃，150 s；共30個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。(2)MDR特異基因片段(約162 bp)檢測(cè)：DNA提取方法同上。引物設(shè)計(jì)：上游引物CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG，下游引物：GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA。擴(kuò)增方法：在離心管內(nèi)加入下列內(nèi)容物：10x bf 2.5 μL，MgCl2 2.5 μL，DNTP(2 mM)2.5 μL,Primers 1.0 μL(each)，DDW 14.0 μL，Target 2.0 μL，95℃,5 min；Tag 0.5 μL，94℃ 30 s，55℃ 60 s，72℃ 70 s，共30個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)增加1 s,720C延伸10 min。用1.5%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同次數(shù)順鉑沖擊后細(xì)胞耐藥性檢測(cè)及IC50測(cè)定結(jié)果

2.1.150 μmol/L順鉑沖擊4次后不同濃度順鉑對(duì)親本細(xì)胞和耐藥誘導(dǎo)細(xì)胞的生長抑制情況及IC50結(jié)果，見表1。

表1 正常SGC-7901細(xì)胞和經(jīng)5 0 μmol/L順鉑沖擊4次后SGC-7901細(xì)胞的耐藥檢測(cè)

2.1.250 μmol/L順鉑沖擊6次后不同濃度順鉑對(duì)親本細(xì)胞和耐藥誘導(dǎo)細(xì)胞的生長抑制情況及IC50結(jié)果，見表2。

表2 正常SGC-7901細(xì)胞和經(jīng)5 0 μmol/L順鉑沖擊6次后SGC-7901細(xì)胞的耐藥檢測(cè)

2.2 耐藥SGC-7901細(xì)胞MDR及特異性片段表達(dá)檢測(cè)

MDR1全長大約4.7 kb，從圖1可以看出，在此位置上可見一泳帶，證明提取胃癌細(xì)胞SGC-7901順鉑耐藥細(xì)胞有MDR1基因的表達(dá)，而親本SGC-7901細(xì)胞沒有表達(dá)。

圖1 耐藥SGC-7901細(xì)胞MDR表達(dá)

MDR1特異片段大約167 bp，從圖2電泳結(jié)果可見，在誘導(dǎo)4次和6次的耐藥SGC-7901在167 bp附近有1條泳帶，而親本細(xì)胞沒有表達(dá)。

圖2 耐藥SGC-7901細(xì)胞特異性片段表達(dá)

3 討論

腫瘤細(xì)胞耐藥是影響治療效果的重要原因之一。腫瘤耐藥的產(chǎn)生有多種原因，其中有原藥耐藥和多藥耐藥。原藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)已經(jīng)用過的藥物產(chǎn)生的耐藥，而MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)1種藥物產(chǎn)生耐藥后，對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能以及作用機(jī)制不同的多種藥物都產(chǎn)生了耐藥。多藥耐藥大部分發(fā)生于單用高劑量給藥或聯(lián)合用藥后存活下來的部分細(xì)胞[4-5]，也就是腫瘤干細(xì)胞(CSCs)。CSCs雖然僅占腫瘤細(xì)胞的一小部分，但它卻有強(qiáng)大的自我更新能力，形成與親代細(xì)胞完全相同的腫瘤細(xì)胞，是腫瘤復(fù)發(fā)的根源[6-7]。

目前，鉑類藥物是最常用的周期非特異性抗腫瘤藥物，它是多種腫瘤治療藥物的首選。其中，順鉑(DDP)是使用廣泛的化療藥物之一[8]。但是由于鉑類抗腫瘤藥物結(jié)構(gòu)上的相似，使其很容易產(chǎn)生原藥耐藥或交叉耐藥，造成化療治療的失敗[9]。根據(jù)這一現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)用順鉑誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901產(chǎn)生耐藥性，建立人胃癌細(xì)胞SGC-7901順鉑耐藥模型，為耐藥細(xì)胞的治療等研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最后選擇用50 μmol/L順鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901進(jìn)行反復(fù)沖擊的方法，誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞耐藥，并對(duì)沖擊第4次和第6次的細(xì)胞以及親本細(xì)胞分別做了耐藥抑制率和耐藥基因檢測(cè)，以確認(rèn)耐藥相關(guān)，結(jié)果證明，經(jīng)4次和6次沖擊后，人胃癌細(xì)胞SGC-7901對(duì)順鉑具有較強(qiáng)的耐受力，IC50分別為63.98 μmol/L和66.34 μmol/L，而親本細(xì)胞SGC-7901則分別為20.55 μmol/L和18.22 μmol/L，4次和6次沖擊結(jié)果比較無論是對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組沒有明顯差異，而同次間的比較有顯著差異(P<0.01)，同時(shí)誘導(dǎo)4次和6次的SGC-7901細(xì)胞均有MDR和特異片段表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了SGC-7901/DDP耐藥細(xì)胞株。該細(xì)胞株通過反復(fù)凍存、復(fù)蘇后，仍對(duì)順鉑有較高的耐藥性及MDR的表達(dá)。