張麗紅，張麗珍，錢榮華，劉海燕，白力偉

(秦皇島市婦幼保健院 婦產(chǎn)科，河北 秦皇島066000)

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)是利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)及生物信息分析對(duì)孕婦外周血漿中母體、胚胎游離DNA片段進(jìn)行測(cè)序計(jì)算，分析胎兒染色體是否存在非整倍體變異現(xiàn)象[1-2]。出生缺陷是重要的人類健康問題，包括唐氏綜合征、先天性心臟病、神經(jīng)管缺陷，因此產(chǎn)前篩查、診斷是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。影像學(xué)、血清生化學(xué)等檢查被廣泛應(yīng)用于臨床篩查，然而侵入性產(chǎn)檢、假陽性率較高等問題可能對(duì)孕婦造成一定傷害性風(fēng)險(xiǎn)和心理性問題[3-4]。2011年NIPT技術(shù)開始在臨床中推廣，該方法在孕周達(dá)到10周以上時(shí)即可采血進(jìn)行，不僅提前了診斷時(shí)間，而且容易被孕婦接受[5]。在我國每年有約90-100萬出生缺陷兒，屬于出生缺陷高發(fā)國家，因此防治遺傳病，控制出生缺陷是重中之重，產(chǎn)前檢查是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[6-7]?；谏鲜銮闆r，本研究擬對(duì)秦皇島地區(qū)2萬名孕婦的產(chǎn)前情況進(jìn)行分析，采集其外周血進(jìn)行NIPT檢查，分析本地區(qū)NIPT不同人群分布情況，探討NIPT技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧秦皇島市婦幼保健院產(chǎn)科門診收集的2017年6月至2019年12月選擇NIPT產(chǎn)前篩查的孕婦，共2萬例。年齡18-46歲，平均年齡(33.24±2.08)歲；孕周12-24周，BMI<28 kg/m2。所有入選者均對(duì)研究知情、同意并簽署同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)、同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕周<12周；近期接受過干細(xì)胞治療、接受過免疫治療，近期異體輸血或進(jìn)行移植手術(shù)；夫婦一方存在染色體異常者；孕婦患有惡性腫瘤者；胎兒在超聲檢查時(shí)提示存在結(jié)構(gòu)性異常者。對(duì)入選者進(jìn)行分類指征統(tǒng)計(jì)，若NIPT檢測(cè)結(jié)果為陽性，則進(jìn)行羊水穿刺診斷。

1.2 研究方法

1.2.1采樣及樣品處理 采集孕婦6 ml靜脈血，置于EDTA抗凝管中，混勻、4℃保存。樣本采集8 h內(nèi)進(jìn)行離心處理，4℃、1 600 g離心(低速離心以防止紅細(xì)胞破裂)、10 min，取上清液分裝1.5 ml為1份。將同份2管抗凝全血上層血漿置于1.5 ml無菌EP管內(nèi)0.9-1 ml；將同份2管抗凝全血白膜層移至1.5 ml無菌EP管中，收集沉淀白膜層，在-80℃環(huán)境下凍存。將上述所得全血血漿在4℃環(huán)境下，采用18 000 g離心(高速離心以去除血漿中殘存的細(xì)胞，4℃環(huán)境下可以避免因離心溫度升高所致的細(xì)胞破壞和游離DNA的釋放)，10 min。冰盒上取上清液800 μl分別轉(zhuǎn)入2個(gè)新的1.5 ml的無菌EP管中，各400 μl，貼血漿編號(hào)、條碼、封口、密封，2管為1個(gè)標(biāo)本的血漿量，保存于-80℃冰箱中凍存。操作時(shí)避免吸取離心管管底殘留細(xì)胞。

1.2.2采取過柱法提取血漿游離DNA 將400 μl血漿和10 μl蛋白酶K混合后加入400 μl的裂解液，短離、混勻；在56℃水浴下10 min，在第5 min時(shí)緩慢上下顛倒EP管1次，以免DNA降解和更長時(shí)間的孵育，室溫冷卻5 min，短暫離心；加入400 μl冰凍無水乙醇，點(diǎn)觸式震蕩15 s，注意為避免后續(xù)操作中堵塞純化柱，需要多震蕩，短暫離心；每管吸取650 μl樣本置于吸附柱內(nèi)，室溫下離心，18 000 g，1 min，棄廢液，對(duì)余下的樣本加至試劑盒內(nèi)。轉(zhuǎn)入提取柱內(nèi)，8 000 rpm離心30 s，棄濾液并加入500 μl清洗液，8 000 rpm、離心、30 s；棄濾液，加入500 μl清洗液，8 000 rpm離心，30 s；棄濾液，12 000 rpm離心，2 min，將提取柱置于1.5 ml收集管上晾干3 min，加入47 μl洗脫液5 min溶解；12 000 rpm離心、2 min，1.5 ml收集管回收DNA。

1.2.3文庫建立及測(cè)序 將血漿提取游離DNA進(jìn)行缺口補(bǔ)平及相應(yīng)部分5’端磷酸化、3’端去磷酸化后使用連接酶、標(biāo)簽、接頭，構(gòu)建可測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)文庫。文庫定量通過PCR擴(kuò)展、與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)。判斷合格文庫標(biāo)準(zhǔn)：R2>99%、Slope>-3.6、effect>90%、Tm<81、NTC無擴(kuò)增、雙峰、無髖峰、dimer。在質(zhì)檢合格文庫均一化后，變性、稀釋、中和，加入測(cè)序孔中進(jìn)行高通量測(cè)序。采用BioelevtronSeq4000測(cè)序儀，對(duì)每個(gè)基因芯片中的反應(yīng)孔讀取一段短序列，即read根據(jù)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)分析進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 將孕婦樣本DNA序列數(shù)據(jù)與人的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算各染色體的Z值，統(tǒng)計(jì)染色體非整倍體異常情況。低風(fēng)險(xiǎn)：Z值≤3.0且≥-3.0；三體高風(fēng)險(xiǎn)：Z值>3.0；單體高風(fēng)險(xiǎn)：Z值<-3.0。若孕婦樣本結(jié)果為單體高風(fēng)險(xiǎn)、三體高風(fēng)險(xiǎn)，即需要進(jìn)行羊水穿刺診斷。

1.2.5羊水穿刺 在超聲引導(dǎo)下抽取，將最初抽取到的孕婦1-2 ml羊水棄掉，取羊水20 ml，分別置于2個(gè)10 ml的無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)；離心1 000 r/min、10 min，棄上清液，保留2.5-3.0 ml細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)基中，在37℃、5%的二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)6-7天，觀察細(xì)胞生長情況，取培養(yǎng)瓶上清液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)顯微鏡下可見多個(gè)克隆、有較多中期分裂細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行羊水染色體收集、制片，G帶(必要時(shí)加C帶)染色，分析30個(gè)中等長度、分散好的中期分裂相，當(dāng)有嵌合體或異常核型出現(xiàn)時(shí)增加計(jì)數(shù)到100個(gè)分裂象并增加分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以“例”表示，比較采取卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕婦NIPT檢測(cè)分類指證統(tǒng)計(jì)情況

從表1的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，高齡孕婦檢測(cè)占23.77%(4 754/20 000)，自愿檢測(cè)占50.99%(10 199/20 000)，二胎檢測(cè)占12.60%(2 520/20 000)，NT增厚占3.08%(615/20 000)，錯(cuò)過其他篩查時(shí)機(jī)占3.55%(710/20 000)，血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)占10.51%(2 101/20 000)，其他情況包括科普宣傳時(shí)參加NIPT檢測(cè)的、定期產(chǎn)檢隨機(jī)參加者，以及其他參與情況等，占1.89%(377/20 000)。

表1 孕婦NIPT檢測(cè)分類情況(例)

2.2 孕婦進(jìn)行NIPT篩查的檢出情況

從表2可以看出，檢出率較高的分類主要集中在血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、高齡妊娠、錯(cuò)過其他篩查時(shí)機(jī)，其次是自愿檢測(cè)。

表2 產(chǎn)前分類檢出陽性情況[篩出例數(shù)(檢出率%)]

2.3 孕婦產(chǎn)前NIPT結(jié)果的符合情況

本研究由NIPT篩選出常染色體非整倍數(shù)共208例(T21+T18+T13)，性染色體異常共188例；染色體總異常陽性率為1.98%(396/20000)；T21占0.82%，T18占0.13%，T13占0.09%，45,XO-Turner綜合征占0.66%，47，XYY-超雄綜合征占0.06%，47，XXX-超雌綜合征占0.22%。最終確診患者306例，染色體總異常發(fā)生率為1.53%(306/20000),符合率為77.27%。從表3可以看出，T21與47，XYY-超雄綜合征的符合率較高。

表3 產(chǎn)前NIPT檢查與羊水穿刺結(jié)果比較

3 討論

染色體非整倍體疾病是指染色體數(shù)目異常的配子相結(jié)合形成的非整倍體合子，表現(xiàn)為細(xì)胞中某些染色體數(shù)目減少或增加，有異于常人的46條染色體，是胎兒最常見的染色體畸形，是胎兒發(fā)生缺陷性疾病的最常見病因之一[8-9]。人類最常見的3種染色體非整倍體疾病包括21-三體綜合征、18-三體綜合征(又名愛德華氏綜合征)和13-三體綜合征(又名帕陶氏綜合征)，其中以21-三體綜合征(又名唐氏綜合征)最為常見，在新生兒發(fā)病率約為1/800[10-12]。由于目前醫(yī)療水平對(duì)于出生缺陷性疾病無特效治法，因此產(chǎn)前篩查，適時(shí)終止妊娠是提高人口素質(zhì)、降低圍產(chǎn)兒死亡率的有效措施。傳統(tǒng)的產(chǎn)前檢查包括血清學(xué)篩查、超聲等無創(chuàng)性手段，以及羊膜腔穿刺、臍靜脈穿刺、絨毛膜取樣等侵入性診療手段；然而前者存在較高的假陽性，后者雖準(zhǔn)確性較高但具有宮內(nèi)感染、流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于胎兒正常發(fā)育具有不利影響[13-15]。NIPT屬于無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查，包括數(shù)字PCR、基因芯片、NGS、單分子DNA成像等檢測(cè)方法，其中臨床最常用的NGS檢測(cè)法又可分為靶向測(cè)序和全基因組大規(guī)模平行測(cè)序兩類[16-17]。據(jù)多項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NIPT無流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，創(chuàng)傷性較小，且準(zhǔn)確性較高。

本次研究通過回顧本院2017年-2019年間開展NIPT篩查技術(shù)的情況發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)自愿檢測(cè)人數(shù)比例高達(dá)50.99%，說明NIPT這種無創(chuàng)性檢測(cè)容易被孕婦及其家屬接受，易于在人群中開展。同時(shí)，從篩查人群的分類統(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn)，高齡孕婦、二胎孕婦等特殊人群的主動(dòng)檢測(cè)率分別為23.77%和12.60%，具有較高的主動(dòng)性。傳統(tǒng)的孕中期血清學(xué)篩查主要針對(duì)唐氏綜合征、愛德華氏綜合征和神經(jīng)管缺陷，然而其單指標(biāo)的異常往往還提示具有其他不良妊娠風(fēng)險(xiǎn)的可能，從本次篩查結(jié)果來看血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦在NIPT檢查中存在有帕陶氏綜合征，以及45,XO-Turner綜合征、47，XYY-超雄綜合征、47，XXX-超雌綜合征等性染色體異常者，說明血清學(xué)結(jié)果不能覆蓋NIPT檢測(cè)結(jié)果，而NIPT不僅可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢查的假陽性現(xiàn)象，而且可以更加明確核型。張莉等[18]對(duì)孕中期2 811例孕婦在血清學(xué)篩查基礎(chǔ)上進(jìn)行NIPT檢查，認(rèn)為NIPT可作為血清學(xué)篩查的序貫手段，以提高檢出率、降低母嬰損害。從本次NIPT開展情況來看，該方法對(duì)于常見的染色體非整倍體疾病的檢出率均較高，且在羊水穿刺這一產(chǎn)前金標(biāo)準(zhǔn)的核對(duì)下，其符合率在唐氏綜合征和47，XYY-超雄綜合征的表現(xiàn)也較好。羊膜腔穿刺采集羊水來進(jìn)行核型分析，是目前臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而產(chǎn)前診斷手術(shù)具有1%-3%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，且會(huì)給孕婦帶來焦慮、恐懼等不良心理，依從性較差。

NIPT對(duì)孕婦外周血中cffDNA，通過高通量測(cè)序及生物信息分析來預(yù)測(cè)胎兒染色體疾病，而cffDNA并非直接的胎兒DNA物質(zhì)，是源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此若存在影響cffDNA的因素必然會(huì)產(chǎn)生不同的檢測(cè)結(jié)果[19-20]。從本次結(jié)果的符合率來看，帕陶氏綜合征、45,XO-Turner綜合征均較低，說明NIPT存在假陰性、假陽性現(xiàn)象。分析其原因可能是：孕婦本身染色體具有異常、染色嵌合體等造成受檢血漿非整倍體cffDNA含量改變；或胎盤為嵌合體而胎兒染色體核型并非異常，這就是研究中發(fā)生假陽性的原因；或NIPT在生物學(xué)原因的干擾下產(chǎn)生假陽性，如帕陶氏綜合征的鳥嘌呤脫氧核糖核酸、胞嘧啶脫氧核糖核酸含量均低，即會(huì)造成NIPT測(cè)序時(shí)發(fā)生較高的偏差；或孕婦個(gè)體發(fā)生了性染色體嵌合，繼而影響NIPT對(duì)胎兒不同類別性染色體異常的陽性預(yù)測(cè)值，由于孕婦臨床的多樣性、復(fù)雜性，使得NIPT對(duì)于性染色體檢測(cè)中假陽性偏高，這可能是本次觀察中NIPT除了對(duì)于47，XYY-超雄綜合征符合率較高，其他性染色體異常符合率均較低的原因。李秀娟等[21]對(duì)3 164例高齡孕婦進(jìn)行NIPT檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NIPT對(duì)于胎兒性染色體異常的符合率差異較大，特別是45,XO-Turner綜合征符合率僅為55.56%，這與本次觀察情況一致。

綜上所述，NIPT在胎兒非整倍體染色體篩查中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，降低了產(chǎn)前診斷風(fēng)險(xiǎn)、提高了孕婦依從性。從實(shí)踐結(jié)果來看，NIPT受各種因素影響存在假陽性、假陰性，因此NIPT檢測(cè)現(xiàn)階段可作為一種篩查途徑，不能將NIPT高風(fēng)險(xiǎn)作為引產(chǎn)指證。在今后的研究中，隨著測(cè)序深度的增加，信息分析的進(jìn)一步全面等，NIPT的準(zhǔn)確性將得到提升，篩查范圍也將進(jìn)一步拓展。