宋 雪，吳靜悅，張 娟，吉嚴(yán)蓉，景杰翔，柯亨特

(蘇州大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

癌癥已成為當(dāng)今社會(huì)人類生命健康的重大威脅之一。臨床上廣泛使用的癌癥治療方式主要包括外科手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療等。這些治療方法雖然成功地減少了癌癥死亡率，但仍面臨著缺乏特異性、療效有限、毒副作用較大等諸多問題[1]。光熱治療(Photothermal Therapy，PTT)是近年飛速發(fā)展的一種微創(chuàng)腫瘤治療技術(shù)，它利用光吸收材料在光照下將光能轉(zhuǎn)化為熱能，產(chǎn)生局部高熱量，從而直接導(dǎo)致癌細(xì)胞因受熱而損傷、凋亡和消融[2-3]。多種具有杰出的近紅外吸收能力的材料已被開發(fā)研究并用于光熱治療，包括Au納米材料、CuS納米粒、鈀納米片、碳納米材料等[4-8]。CuS納米粒子作為一種新型的無機(jī)半導(dǎo)體光吸收劑，它在近紅外區(qū)域有強(qiáng)烈的吸收，最大吸收峰在900～1 000 nm，而且吸收峰不會(huì)隨著粒子大小和形狀的改變而發(fā)生改變，具有良好的光熱穩(wěn)定性，且制備方法簡單、成本低[6, 9-11]。

為了實(shí)現(xiàn)最佳療效，光熱治療前還需完成腫瘤的定位、腫瘤大小的確定，還需確保光吸收材料在病灶部位足夠的富集濃度，并對(duì)治療過程實(shí)行監(jiān)測(cè)。因此，光熱治療需要通過其他影像方法的指引和輔助來確保治療過程能順利進(jìn)行，并期望能及時(shí)獲取反饋信息，以便采取下一步治療方案。這種將診斷和治療結(jié)合為一體的腫瘤治療方法稱為診療一體化(Theranostics)[12-14]。磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)是利用生物體內(nèi)的不同組織或器官在強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下產(chǎn)生磁共振信號(hào)，經(jīng)過圖象重建而成像的一種技術(shù)[15]，能為腫瘤治療提供有價(jià)值的解剖學(xué)信息和體內(nèi)分布信息，可有效指導(dǎo)和監(jiān)測(cè)腫瘤的光熱治療過程[16-17]。MRI是分子成像手段中一個(gè)最有力的和非侵入性的診斷技術(shù)，基于質(zhì)子與組織周圍分子的相互作用，能為腫瘤治療提供有價(jià)值的解剖學(xué)信息和體內(nèi)生物分布信息[18-19]。Mn3O4是一種具有良好順磁性的造影劑，價(jià)格低廉且制備成本低[20-23]?？蓪⑵渲瞥沙叽绾线m的納米粒，并在表面修飾功能基團(tuán)，使之成為具有診斷、成像、治療等多種功能的復(fù)合納米粒。這不僅可以增強(qiáng)其對(duì)癌細(xì)胞的靶向能力，還能降低Mn離子作為金屬元素而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。因此本研究采用具有良好生物相容性的聚合物納米藥物載體，共包載Mn3O4順磁性MRI造影劑和具有較強(qiáng)近紅外光吸收能力的CuS納米粒，構(gòu)建集磁共振成像與光熱治療為一體的多功能核殼納米粒，實(shí)現(xiàn)腫瘤的診療一體化。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)儀器

所使用材料如下：聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)(濟(jì)南岱罡生物科技有限公司，特性粘度：0.54 dL/g，LA∶GA=50∶50，分子量：63 kDa)；油胺(上海晶純生化科技股份有限公司)；乙酰丙酮錳(C15H21MnO6)(北京百靈威科技有限公司)；一水乙酸銅(Cu(CH3COO)2·H2O)、Na2S·9H2O、NaOH(上海國藥集團(tuán))；牛血清白蛋白BSA(沃凱生物醫(yī)藥公司)。 所使用實(shí)驗(yàn)儀器如下：真空干燥機(jī)(Martinchrist)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司， JY92-II)；紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(日本島津精密儀器公司，UV-2600)；激光粒度儀(美國馬爾文， Nano-ZS90)近紅外激光器(785 nm、980 nm，長春飛秒科技有限公司)；透射電鏡(美國FEI公司，Tecnai G220)。

1.2 方法

1.2.1 油胺穩(wěn)定的Mn3O4納米粒的制備

采用高溫?zé)峤夥ㄖ苽鋄24]：①精密稱取11.97 g油胺，0.45 g乙酰丙酮錳C15H21MnO6，超聲分散混合均勻后共置于干燥潔凈的100 mL三頸瓶中，放入干燥潔凈的磁力攪拌子，連接冷凝管，通入氮?dú)?，直至反?yīng)儀器中原有的空氣完全排除；②在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，用加熱套加熱至162 ℃，磁力攪拌反應(yīng)11 h，冷卻至室溫后，12 000 r/min高速離心15 min得到棕色沉淀；③取沉淀物，用4～5 mL乙醇超聲與渦旋分散后，3 500 r/min離心洗滌3次，得到Mn3O4納米粒，分散于6 mL的正己烷中。

1.2.2 CuS白蛋白納米粒的制備

采用白蛋白模板法制備[9,25]：①溶液配制：20.0 mM的乙酸銅(Cu(CH3COO)2)溶液；35.0 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液；100.0 mM Na2S溶液；2.0 M氫氧化鈉溶液。②取BSA溶液20.0 mL置于50 mL的離心管中，加入4.0 mL Cu(CH3COO)2溶液，在磁力攪拌器上劇烈攪拌1 min，溶液混合均勻后，邊攪拌邊加入2.0 M的NaOH溶液，將反應(yīng)體系的pH調(diào)至12；③劇烈攪拌5 min后，加入配好的Na2S溶液3.5 mL，反應(yīng)體系變?yōu)辄S褐色；④將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到55 ℃水浴鍋中攪拌反應(yīng)4 h。得到CuS白蛋白納米粒，用去離子水持續(xù)透析24 h，制成CuS白蛋白納米粒的水分散液待用。

1.2.3 核殼納米粒的制備

①取80.0 μL上述制備的含Mn3O4納米粒的正己烷分散液置于通風(fēng)櫥，完全揮發(fā)正己烷(CH3(CH2)4CH3)；②用分析天平稱取5.0 mg的PLGA溶解于0.2 mL的二氯甲烷(CH2Cl2)中，得到25.0 mg/mL的PLGA/CH2Cl2溶液，并以此溶解Mn3O4納米粒；③將此混合液加入到4.0 mL的含CuS白蛋白納米粒的水分散液中，用超聲波細(xì)胞粉碎儀對(duì)混合液進(jìn)行探針超聲乳化(功率400 W，超聲時(shí)間2 s，間隔時(shí)間2 s，90次)；④將此乳濁液轉(zhuǎn)移到小玻璃瓶內(nèi)，放入干燥潔凈的磁力攪拌子，置于通風(fēng)櫥中，在磁力攪拌器上持續(xù)攪拌揮發(fā)6 h，直至CH2Cl2完全揮發(fā)；⑤對(duì)制備的水分散液進(jìn)行離心洗滌，即得到核殼納米粒(Mn3O4/PLGA@CuS)。

PLGA是經(jīng)美國FDA認(rèn)證的藥用輔料，它是一種無毒且可以被人體降解的功能性有機(jī)高分子化合物，具有良好的生物相容性，因此可以被廣泛應(yīng)用于納米材料、藥物載體、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域和制藥行業(yè)。本研究采用PLGA作為載體，通過超聲乳化-溶劑揮發(fā)法，共包載油溶性的Mn3O4納米粒以及水溶性的CuS白蛋白納米粒，其制備過程如圖1。

圖1 核殼納米粒的制備示意圖

1.2.4 核殼納米粒的理化性質(zhì)表征

通過透射電鏡、粒徑分布儀、紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)對(duì)于核殼納米粒的形態(tài)、粒徑、吸收光譜進(jìn)行表征；采用醫(yī)用磁共振成像儀對(duì)制備的核殼納米粒進(jìn)行MRI造影能力的表征，通過醫(yī)用磁共振成像儀測(cè)定其縱向弛豫時(shí)間T1加權(quán)的磁共振增強(qiáng)圖像，并計(jì)算其縱向弛豫率r1；采用785、980 nm激光器測(cè)定不同濃度核殼納米粒的光熱誘導(dǎo)升溫曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 核殼納米粒的理化性質(zhì)

透射電鏡結(jié)果可見，通過高溫?zé)峤夥ㄖ苽涞腗n3O4納米粒大多呈現(xiàn)出球形或接近球形的結(jié)構(gòu)，平均粒徑大約為(10 ± 2.1) nm，粒徑均一且分散性較好(圖2(a))。從圖2(b)可以看到，通過蛋白模板法制備的CuS白蛋白納米粒呈現(xiàn)球形或類球形的結(jié)構(gòu)，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算其粒徑大約為(12 ± 0.9) nm，粒徑較為均一。采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備得到的核殼納米粒在電鏡圖中可觀察到球形或類球形的核殼結(jié)構(gòu)，粒徑在100～200 nm，證明核殼納米粒的成功制備(圖2(c))。

圖2 透射電鏡表征

動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果顯示，核殼納米粒的粒徑呈正態(tài)分布，平均粒徑為160 nm，多分散系數(shù)PDI為0.272(圖3)。較小且分布較為均一的尺寸可使納米粒更易于通過EPR效應(yīng)滲透到達(dá)腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)較高的局部濃度，有助于腫瘤高效診斷和治療。核殼納米粒的線掃描元素分析結(jié)果顯示，核殼納米粒含Cu、Mn兩種元素，且Cu在外側(cè)含量較高，Mn在內(nèi)部含量較高(圖4)。該結(jié)果證明我們成功制備出以CuS納米粒為外殼，內(nèi)核為聚合物與氧化錳納米粒的核殼納米粒(Mn3O4/PLGA@CuS)。

圖3 核殼納米粒的粒徑分布

圖4 核殼納米粒的線掃描元素分析結(jié)果

Mn3O4納米粒、CuS白蛋白納米粒和制備得到的核殼納米粒的吸收光譜如圖5所示。Mn3O4納米粒在400～1 200 nm的范圍內(nèi)無明顯的特征吸收峰，而CuS白蛋白納米粒在近紅外區(qū)的700～1 200 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)較為明顯的吸收峰，可通過近紅外光照射實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的光熱效應(yīng)。核殼納米粒在400～1 200 nm的范圍內(nèi)均有較強(qiáng)吸收且呈遞減趨勢(shì)，同時(shí)在近紅外區(qū)(700～1 200 nm)出現(xiàn)類似CuS納米粒的較強(qiáng)的吸收，提示其對(duì)近紅外光有明顯的吸收作用，具有較強(qiáng)的光熱效應(yīng)。

圖5 Mn3O4納米粒、CuS白蛋白納米粒和核殼納米粒的吸收光譜

2.2 體外磁共振成像

圖6(a)是不同Mn濃度的核殼納米粒水分散液在磁共振成像儀中得到的T1加權(quán)的MRI造影成像圖,可以看出，隨著納米粒水分散液中Mn濃度的升高(從左到右)，其對(duì)應(yīng)的信號(hào)值逐漸增強(qiáng)(亮度變亮)，表明該納米粒的磁共振造影性能具有Mn濃度依賴性?？v向弛豫時(shí)間的倒數(shù)(1/T1)與濃度間的關(guān)系作圖，采用線性擬合得到該核殼納米粒的r1值為1.351 mM-1·s-1，表明其具備良好的磁共振造影能力(圖6(b))。

圖6 核殼納米粒的體外磁共振成像圖及r1值

2.3 光熱效應(yīng)評(píng)價(jià)

本研究采用蛋白模板法進(jìn)行CuS白蛋白納米粒的制備。白蛋白上具有多個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，可通過氨基末端或者半胱氨酸殘基有效結(jié)合金屬離子，形成白蛋白-金屬離子復(fù)合物[26]。結(jié)合的金屬離子可通過還原反應(yīng)或沉淀反應(yīng)成核結(jié)晶，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，控制納米結(jié)晶在白蛋白空腔中的生長，形成內(nèi)部為無機(jī)納米材料、表面為白蛋白的核殼型納米粒[3, 9, 16, 25 27-29]。該方法具有生物相容性好、粒徑可控、工藝簡單等特點(diǎn)，可通過生物礦化作用實(shí)現(xiàn)無機(jī)納米粒的可控合成，具有良好的生物應(yīng)用前景。

我們分別考察了CuS白蛋白納米粒和核殼納米粒在785 nm和980 nm激光照射下的光熱升溫效應(yīng)(圖7、圖8)。

如圖7(a)、(b)可見，在785 nm激光照射下，去離子水幾乎不升溫，而不同Cu濃度(0.05、0.10、0.20和0.50 mM)的核殼納米粒在5 min時(shí)分別升高了7.9、13.0、20.1和36.0 ℃，隨著濃度的增大升溫效果增強(qiáng)，顯示其濃度依賴的光熱升溫效果，并且濃度相同情況下，核殼納米粒比CuS納米粒的光熱升溫效應(yīng)更為顯著。而在980 nm激光照射下，核殼納米粒與CuS相比并未表現(xiàn)出明顯提升，但仍可說明核殼納米粒不會(huì)影響所負(fù)載的CuS納米粒的光熱效果(圖8(a)、(b))。雖然核殼納米粒溫度提升最高可達(dá)到50.9 ℃，但由于水在980 nm處具有較強(qiáng)吸收，可在該波長激光照射下升溫約28 ℃。因此，785 nm波長的激光由于較好的避開了水的吸收， 具有較好的選擇性和低毒副作用， 將更有潛力應(yīng)用于腫瘤光熱治療。

圖7 785 nm激光照射下納米粒的光熱升溫效應(yīng)

圖8 980 nm激光照射下納米粒的光熱升溫效應(yīng)

3 結(jié) 論

癌癥已成為現(xiàn)今社會(huì)嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病之一，并且發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，研究并構(gòu)建診斷治療一體化納米藥物，對(duì)實(shí)現(xiàn)腫瘤高效診治具有重要意義。

本文通過高溫?zé)峤夥ㄖ苽銶n3O4納米粒，同時(shí)采用蛋白模板法制備CuS白蛋白納米粒，最后以可降解性高分子PLGA作為載體，通過超聲乳化的方法，制成共包裹Mn3O4和CuS納米粒的核殼納米粒。該納米粒具有如下特征：

1)核殼納米粒具有球形或類球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑為160 nm，分散較為均一且穩(wěn)定性較好，在近紅外區(qū)有較強(qiáng)吸收；

2)體外磁共振成像研究表明該核殼納米粒保留了Mn3O4納米粒的MRI造影劑功能；

3)同時(shí)，體外光熱效應(yīng)研究表明該納米粒具有較強(qiáng)的光熱治療能力，可用于腫瘤的診療一體化，在磁共振造影成像的引導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)腫瘤的光熱消融治療。