李 麗，張辛銘，尹雙輝，張濤濤，楊順利，薛慧文

(1.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；2.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046；3.石家莊市獸用生物制品供應站，河北石家莊 050027)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，是引起豬流行性腹瀉(Poreine epidemic diarrhea，PED)的病原。PED是一種急性接觸性傳染病，病豬的主要特征為腹瀉、嘔吐和脫水，對哺乳仔豬具有較高致死率。流行病學調查表明，PEDV已經(jīng)遍及全球，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[1-2]。膜蛋白(M)在PEDV結構蛋白中含量最多，在補體共同作用下能夠誘導機體產生中和抗體。M蛋白編碼基因與其它冠狀病毒的M基因有較低的相似性，但是在不同PEDV毒株間具有較高的相似性。因此，M蛋白是PEDV檢測以及病原成像等研究的理想靶標蛋白。

駝科和軟骨魚等動物體內存在著一種天然缺失輕鏈、僅有重鏈的抗體，稱之為重鏈抗體(heavy chain antibodies，HCAbs)[3]。這類抗體僅通過重鏈可變區(qū)形成的結構來特異性識別和結合抗原，故稱此可變區(qū)結構片段為單域抗體(single domain antibody，sdAb)。sdAb是目前可以得到的具有完整功能的最小抗體分子，分子質量僅15 ku，是單克隆抗體分子質量的1/3，又稱為納米抗體(nanobody)。sdAb具有結構簡單易于基因工程改造，容易重組表達、高水溶性、耐高溫和極端pH等獨特性質[4-5]。此外，sdAb具有較強的組織滲透性，甚至能通過血腦屏障[6-7]，在腫瘤成像、腫瘤治療和小分子抗體治療藥物研發(fā)等領域具有廣闊應用前景[8-11]。本實驗室前期篩選到了M蛋白特異性sdAb，并證實其具有較好的PEDV結合活性，在PEDV檢測和分離方面具有較好的應用價值。然而，由于sdAb不具有自主進入動物細胞的特性，限制了其在治療性抗體研發(fā)以及PEDV成像示蹤方面的應用。

細胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)也稱為蛋白質轉導結構域，是一類含有約5～30個氨基酸的短肽，自身具有跨膜轉運功能，能夠攜帶核酸、蛋白質等生物大分子進入細胞發(fā)揮功能，且沒有細胞毒性。TAT短肽(transactivator)是人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的反式激活因子，是最早被報道的CPPs[12]。目前，TAT短肽已經(jīng)被用作向細胞內遞送包括小分子核酸(DNA、RNA和siRNA)、多肽、蛋白質、病毒、成像劑、藥物以及各種納米顆粒等的有效工具。

本研究將TAT穿膜肽與抗PEDV膜蛋白M的特異性sdAb進行融合表達，獲得帶有TAT短肽的重組sdAb(TAT-sdAb)。用ELISA方法檢測TAT-sdAb與M蛋白的結合活性，通過免疫熒光技術分析TAT-sdAb進入Vero細胞的特性，并對TAT-sdAb與細胞內的PEDV進行共定位。本研究獲得的具有穿膜活性和抗原結合活性的重組TAT-sdAb，為PEDV感染的活細胞檢測和示蹤提供了材料基礎，為治療性sdAb的研發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性內切酶BamHⅠ和XholⅠ，英國NEB公司產品；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒和大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞，中國全式金生物公司產品；0.45 μm濾膜，美國Millipore公司產品；異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，上海生工生物工程有限公司產品；His-tag純化樹脂，德國Qiagen公司產品；多聚甲醛固定液，中國索萊寶生物公司產品；HRP和FITC標記抗His-tag抗體，TRITC標記抗鼠抗體，美國Abcam公司產品；DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司產品；胎牛血清，中國四季青公司產品；細胞培養(yǎng)瓶、激光共聚焦顯微鏡觀察實驗用培養(yǎng)皿(24 mm)，美國Corning公司產品；pET-32a表達載體、PEDV核蛋白單克隆抗體、膜蛋白特異性sdAb和重組表達的PEDV M蛋白，中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所豬禽消化道感染和黏膜免疫研究創(chuàng)新團隊實驗室保存；其他常規(guī)試劑為國產分析純。

1.1.2 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(HERAcell vios 160i)，Thermo Fisher Scientific公司產品；蛋白電泳儀(PowerPac)和酶標儀(iMark)，Bio-Rad公司產品；超聲波破碎儀(SCIENTZ-950E)，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8X)，Leica公司產品。

1.2 方法

1.2.1 PEDV特異性單域抗體與穿膜肽的融合表達及與M蛋白結合活性分析 將TAT穿膜肽基因與實驗室保存的抗PEDV M蛋白的特異性單域抗體sdAb-Mc30(MH550666)[13]基因，通過引物延伸方法融合，并利用BamHⅠ和XholⅠ酶切位點克隆到pET-32a表達載體，連接產物轉化到大腸埃希氏菌(DH5α)感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆并進行測序分析，陽性質粒命名為32a-TAT-sdAb，轉化到大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落接種到新鮮Lysogeny broth(LB)培養(yǎng)基(含100 μg/mL ampicillin)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按照體積比1%接種量，將菌轉接至新鮮LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL ampicillin)中，振搖至OD 600 nm值約為0.6～0.8，加入終濃度分別為0.001 moL/L、0.002 moL/L、 0.005 moL/L和0.01 moL/L的IPTG，25℃誘導12 h后，8 000 r/min離心收集菌體。用120 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

確定目的蛋白表達以及最佳的IPTG誘導濃度后，大量誘導重組表達菌，收集菌體。用Tris-HCl緩沖液(pH8.0)重懸重組菌，置冰上用超聲儀進行細胞裂解，然后12 000 r/min、4℃離心10 min，收集上清。上清液用0.45 μm濾膜過濾并加入到裝有His蛋白純化樹脂(Ni-NTA agarose resin)的親和層析柱，按操作說明進行目的蛋白純化。獲得的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分析，然后用透析袋更換溶解緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 8.0)，用Nanodrop 2000超微量分光光度計測濃度后，分裝，-80℃保存。

參照已報道的ELISA方法[13]，稀釋重組TAT-sdAb和sdAb至終濃度分別為10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.63 μg/mL、0.32 μg/mL、0.16 μg/mL和0 μg/mL，檢測不同濃度TAT-sdAb與M蛋白的結合活性。

1.2.2 TAT-sdAb穿膜活性分析 利用間接免疫熒光方法(IFA)分析TAT介導sdAb穿膜進入細胞的過程。Vero細胞用DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)(含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將細胞傳代至激光共聚焦顯微鏡觀察用培養(yǎng)皿(24 mm)，培養(yǎng)至70%～80%細胞匯合，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗3次，加入1 mL的DMEM，同時加入TAT-sdAb至終濃度為50 μg/mL，在37℃、5% CO2共孵育3 h；棄掉培養(yǎng)液，PBS洗5次，40 g/L多聚甲醛室溫固定10 min，1 mL/L Triton X100的PBS透膜10 min。固定后的細胞與FITC標記的抗His-tag抗體(1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，DAPI染核5 min，最后用PBS洗5次，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 TAT-sdAb的最適使用劑量分析 將Vero細胞傳代至激光共聚焦顯微鏡觀察用培養(yǎng)皿培養(yǎng)至70%～80%細胞匯合，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗3次，然后加入1 mL的DMEM，并分別加入TAT-sdAb至終濃度為0 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL，設置相同濃度的sdAb為試驗對照，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h。細胞洗滌并固定，與FITC標記的抗His-tag抗體以及DAPI染料孵育，PBS洗滌，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 TAT-sdAb的最適作用時間分析 將Vero細胞傳代至共聚焦顯微鏡觀察實驗用培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至70%～80%細胞匯合，分別加入TAT-sdAb至終濃度為50 μg/mL，在37℃、5% CO2，分別培養(yǎng)0 h、0.5 h、1 h、3 h和5 h；設置不加TAT-sdAb的空白細胞對照。細胞洗滌并固定，與FITC標記的抗His-tag抗體以及DAPI染料孵育，PBS洗滌，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 TAT-sdAb與PEDV胞內共定位 將Vero細胞傳代至激光共聚焦顯微鏡觀察用培養(yǎng)皿接種0.5 MOI的PEDV疫苗株(CV777)，培養(yǎng)12 h，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗3次，加入1 mL的DMEM，同時加入TAT-sdAb至終濃度為50 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。隨后洗滌并固定細胞，分別與FITC標記的抗His-tag抗體、抗PEDV核蛋白單克隆抗體、TRITC標記抗鼠二抗以及DAPI染料孵育，PBS洗滌，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 TAT-sdAb的表達、純化及結合活性分析

將PEDV特異性sdAb與TAT融合，構建表達載體32a-TAT-sdAb，并轉化到大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞(DE3)。加入不同終濃度IPTG誘導，SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)，誘導組均能觀察到大小約為35 ku的特異性條帶，與預測目標蛋白大小相符；利用His-tag蛋白純化樹脂進行純化，可獲得特異性的蛋白條帶(圖1)；ELISA試驗證實不同稀釋度的TAT-sdAb與sdAb具有相似的M蛋白結合活性，表明融合TAT并未影響sdAb的抗原結合活性(圖2)。

M.蛋白分子質量標準；1～4.空白質粒對照；5～8.0.001 moL/L、0.002 moL/L、0.005 moL/L和0.01 moL/L IPTG誘導條件下表達菌，白色箭頭所指為目的條帶；9 .目的蛋白純化。

圖2 ELISA方法分析TAT-sdAb的抗原結合活性分析

2.2 TAT-sdAb穿膜活性分析

為了驗證TAT能否有效介導sdAb進入細胞，分別向Vero細胞中加入TAT-sdAb和sdAb共孵育，利用IFA方法通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內TAT-sdAb和sdAb的分布特征。結果觀察到在TAT-sdAb共孵育Vero細胞的胞質中有明顯的熒光，而與sdAb共孵育的對照細胞內未觀察到明顯的熒光。結果表明融合TAT短肽，使TAT-sdAb具備了穿透細胞膜進入Vero細胞的活性(圖3)。

A.白光觀察的細胞；B.360 nm觀察的細胞；C.488 nm觀察的細胞；D.合并觀察的細胞; T.TAT-sdAb處理組; S.sdAb處理組

2.3 TAT-sdAb的最適使用劑量分析

為了確定TAT-sdAb穿膜的最佳使用劑量，將不同量的TAT-sdAb與Vero細胞共孵育，IFA方法檢測細胞內TAT-sdAb的變化(圖4)。結果發(fā)現(xiàn)，隨著TAT-sdAb蛋白量的增加，Vero細胞內的熒光分布范圍逐漸變大，熒光強度也隨之增加，在使用濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時熒光較為明顯，而sdAb對照組則未見明顯熒光。結果說明TAT-sdAb穿膜進入Vero細胞的活性和效率與使用劑量成正相關，要達到理想的穿膜效果，使用濃度應大于50 μg/mL。

A.0 μg TAT-sdAb；B.1 μg TAT-sdAb；C.10 μg TAT-sdAb；

2.4 TAT-sdAb的最適作用時間分析

為了確定TAT-sdAb穿膜的最適孵育時間，將其與Vero細胞共孵育，IFA檢測TAT-sdAb在細胞內的變化(圖5)。結果發(fā)現(xiàn)，隨著TAT-sdAb與細胞共孵育時間的延長，細胞內熒光點的分布范圍逐漸變大，熒光強度增加；當?shù)? h時，熒光強度尤為明顯。結果說明TAT-sdAb穿膜進入Vero細胞的活性和效率與作用時間成正相關，要達到理想的穿膜效果，作用時間應大于3 h。

A.空白對照；B.0 h；C.0.5 h；D.1 h；E.3 h；F.5 h

2.5 TAT-sdAb與PEDV在細胞內共定位

為了驗證TAT-sdAb進入細胞后能否識別和結合PEDV，將TAT-sdAb與PEDV感染的Vero細胞孵育，用IFA方法進行共定位分析。結果發(fā)現(xiàn)TAT-sdAb(綠色熒光)進入細胞后，與胞內的PEDV(紅色熒光)分布基本一致，在細胞膜和細胞質發(fā)生熒光重疊(圖6)。結果表明TAT-sdAb進入細胞后能識別胞內的PEDV。

A.360 nm觀察的細胞；B.488 nm觀察的細胞；D.549 nm觀察的細胞；E.合并觀察的細胞; T.TAT-sdAb處理組; C.對照組

3 討論

PEDV是威脅養(yǎng)豬業(yè)的重大病原，其傳播的廣泛性和對新生仔豬近100%的致死率，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。本研究小組已經(jīng)利用篩選到的PEDV膜蛋白特異性單域抗體(sdAb-Mcs)，建立了PEDV檢測和分離的方法[13]。為了進一步提高sdAb的研究適用性，本研究嘗試構建帶有穿膜肽的sdAb，旨在獲得具有自主進入細胞活性的sdAb，從而拓寬sdAb的潛在應用。

sdAb是具備抗原結合能力的最小抗體，與傳統(tǒng)抗體相比，sdAb還具有可溶性高、穩(wěn)定性好、親和力高、組織穿透力強以及容易大量生產等優(yōu)點。在生物成像、胞內特定抗原示蹤與檢測、藥物投遞以及作為治療性抗體等方面具有巨大應用潛力[14-16]。然而，在活細胞內特定抗原示蹤成像、藥物投遞以及胞內病原治療性抗體等應用中，通常需要sdAb具備較高的組織和細胞穿透活性。細胞穿膜肽(CPPs)是能夠自主穿過細胞膜進入細胞的一類短肽，有介導sdAb進入細胞的巨大潛力。已有研究證實CPPs可通過內吞和直接穿透等機制運載蛋白質和核酸等生物大分子、成像劑、藥物以及各種納米顆粒進入細胞內發(fā)揮其效應功能[17-19]。CPPs具有生物相容性佳、對細胞造成的毒性小以及能與生物活性蛋白直接融合重組表達等優(yōu)點，因此成為以胞內分子為靶標的藥物遞送技術發(fā)展的重要工具。TAT短肽是一類已經(jīng)被廣泛應用的富含堿性氨基酸的CPPs，具有強烈的穿透細胞膜能力[12]。鑒于此，本研究結合sdAb分子質量小、易于基因工程改造特性以及TAT短肽能穿過哺乳動物細胞膜特性，將sdAb基因與TAT短肽融合表達，成功獲得能在大腸埃希氏菌中(E.coli)可溶性表達的重組TAT-sdAb蛋白。對TAT-sdAb的M蛋白結合活性分析表明，融合TAT并未影響sdAb的抗原結合活性。此外，每升LB培養(yǎng)液可獲得超過5 mg的重組TAT-sdAb抗體(結果未展示)，成本低廉，易于制備，能滿足后續(xù)的各種應用需求。

研究發(fā)現(xiàn)，將蛋白質(如乙二醛酶蛋白和Smar蛋白等)與細胞穿膜肽TAT融合表達后，TAT能夠以時間和劑量依賴的方式將這些蛋白質遞送進入細胞中[20-21]。也有研究證實，將治療性抗體與TAT融合，成功將治療性抗體遞送到細胞內[22]。本研究將TAT-sdAb與Vero細胞共孵育后，發(fā)現(xiàn)TAT-sdAb能夠進入到Vero細胞內，其入胞效率與使用劑量和作用時間成正相關，這也與以前的研究報道相一致。對細胞內PEDV與TAT-sdAb共定位分析發(fā)現(xiàn)，進入細胞的TAT-sdAb與PEDV呈共定位分布，表明重組TAT-sdAb進入細胞后能識別胞內的PEDV病原。因此，TAT-sdAb有望成為PEDV感染細胞動態(tài)示蹤研究中的有力工具。同時，TAT穿膜肽成功介導有病原結合活性的sdAb有效進入細胞，為具有特定活性小分子蛋白的細胞內傳遞提供更多數(shù)據(jù)參考。

總之，本研究將TAT穿膜肽與PEDV特異性sdAb進行了融合表達，獲得了具有抗原結合活性的重組TAT-sdAb；進一步分析證實TAT-sdAb能夠自主進入Vero細胞，并能識別細胞內的PEDV，為PEDV感染動態(tài)過程可視化研究提供了有力工具，同時也為治療性單域抗體的細胞內遞藥提供更多參考。