劉夢(mèng)倩，陶俊宇，胡雯月，韋英益，胡庭俊

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530021；3.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200030)

辣蓼黃酮是中草藥辣蓼的一種有效成分。研究表明，辣蓼黃酮能降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥對(duì)小鼠造成的多臟器損傷[1-2]。辣蓼黃酮能降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7炎性因子分泌[3]。過(guò)量的LPS可激活單核巨噬細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化多種炎性因子[4]。在炎癥反應(yīng)中，激活的NF-κB會(huì)引起一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶2型(COX-2)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等多種炎癥因子的表達(dá)[5-6]。同時(shí)，MAPKs家族參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡和免疫反應(yīng)等多種生理活動(dòng)的p38、ERK與JNK也會(huì)被炎癥因子激活[7]。研究表明，JNK可保護(hù)細(xì)胞不受TNF-α誘導(dǎo)的凋亡，對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用[8]?；罨腏NK可以使c-Jun的ser63和ser73位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而合成誘生型iNOS和TNF-α的特異性轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1。AMPK是炎性調(diào)節(jié)因子，其催化亞基AMPKα1在脂肪組織和巨噬細(xì)胞中有著較高的表達(dá)量，活化的AMPKα1可以抑制巨噬細(xì)胞的炎性[9]。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建體外炎癥模型，測(cè)定炎癥相關(guān)蛋白和磷酸化水平，探究辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 脂多糖，Sigma公司產(chǎn)品；iNOS(D6B6S)兔抗單克隆抗體、COX2(D5H5)兔抗單克隆抗體、MAPK family antibody sampler kit 試劑盒、Phospho-MAPK family antibody sampler kit 試劑盒、AMPKα(D5A2)兔抗單克隆抗體、Phospho- AMPKα(Three172)(40H9)兔抗單克隆抗體、c-Jun(60A8)兔抗單克隆抗體、Phospho-c-Jun(Ser73)兔抗單克隆抗體、β-Actin(13E5)兔抗單克隆抗體、GADPH(14C10)兔抗單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶連接的抗兔IgG，美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；complete tablets EDTA-free蛋白酶抑制劑、phosSTOP磷酸酶抑制劑，瑞士羅氏公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒、10×TBST、Western抗體稀釋液、蛋白膜再生液、麗春紅染色試劑、考馬斯亮藍(lán)染液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(C150)，德國(guó)BINDER公司產(chǎn)品；細(xì)胞超聲破碎儀(JY92-ⅡD)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；純水儀(CD-UPT-1)，成都純?cè)娇萍加邢薰井a(chǎn)品；微量離心機(jī)(TYPE1-14)，SIGMA公司產(chǎn)品；超聲波清洗機(jī)(DTDN)，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(TS100)，Nikon公司產(chǎn)品；搖床(TS-100C)，上海天呈公司產(chǎn)品；垂直電泳槽(Mini-Protein Tetra System)，BIO-RAD公司產(chǎn)品；蛋白半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)(TRANS-BLOT SD)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；蛋白成像系統(tǒng)(Chemi Doc MP)，BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)，廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室采用酶解-超聲偶聯(lián)法提取后的濾液，經(jīng)過(guò)石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯部分，經(jīng)XDA-8大孔吸附樹(shù)脂分離純化,得辣蓼黃酮乙酸乙酯部分 (FEA)。將得到的FEA通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其中蘆丁、槲皮素和槲皮苷的含量。再以蘆丁為參比物，采用紫外分光光度法測(cè)定了所得FEA中總黃酮的含量。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7消化后輕輕吹打至單個(gè)細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度至2×105個(gè)/mL，每孔100 μL加至96孔板中，用100 mL/L FBS的DMEM維持培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜。棄去上清，空白對(duì)照組加入維持培養(yǎng)基，模型組加入含LPS終濃度為1.0 μg/mL的維持培養(yǎng)基，藥物處理組加入含40 μg/mL、80 μg/mL FEA的維持培養(yǎng)基與細(xì)胞孵育2 h、4 h之后棄去上清，再加入含LPS終濃度為1.0 μg/mL的維持培養(yǎng)基，2 h(測(cè)MAPK、AMPKα或c-Jun及其磷酸化)或24 h(測(cè)iNOS與COX-2)時(shí)收集細(xì)胞樣品。

1.2.3 蛋白樣品制備 按1.2.2所述處理細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS洗1次，輕輕吹下收集于EP管中，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入RIPA(1∶1)細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑(1∶100)和磷酸酶抑制劑(1∶1 000)冰上裂解20 min，用超聲破碎儀超聲處理樣品，防止樣品黏稠，分裝后-80℃保存。使用前用蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定各樣本蛋白濃度，使?jié)舛缺３忠恢?，加?×Loading buffer。EP管加封口膜，沸水浴煮沸5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清待測(cè)。

1.2.4 iNOS與COX-2的檢測(cè) 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。iNOS蛋白使用80 g/L的SDS-PAGE膠分離1.5 h，并在3 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)75 min；COX-2蛋白用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)1 h。用BSA在37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

1.2.5 AMPKα與磷酸化AMPKα的檢測(cè) 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。使用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)45 min。用BSA 37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

1.2.6 MAPK家族ERK、JNK、p38及其相應(yīng)蛋白磷酸化的檢測(cè) 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。ERK與p-ERK蛋白用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)35 min；SAPK/JNK與p-SAPK/JNK用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1.5 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)40 min；P38與p-P38用120 g/L的SDS-PAGE膠分離45 min，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)30 min；用BSA 37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

1.2.7 c-Jun與磷酸化c-Jun的檢測(cè) 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。c-Jun與p-c-Jun用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)35 min。用BSA 37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

2 結(jié)果

2.1 iNOS蛋白的表達(dá)

由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，LPS刺激24 h后的模型組的iNOS蛋白表達(dá)水平均極顯著升高；而用40 μg/mL、80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h和4 h后均能極顯著降低iNOS蛋白的表達(dá)。表明FEA預(yù)處理RAW264.7能極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中iNOS蛋白的表達(dá)。

A.空白對(duì)照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.2 COX-2蛋白的表達(dá)

由圖2可知，與空白組相比，LPS刺激24 h后，模型組的COX-2蛋白表達(dá)水平均極顯著升高；用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h和4 h后均能顯著降低COX-2蛋白的表達(dá)水平。表明用80 μg/mL的FEA預(yù)處理后能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中COX-2蛋白的表達(dá)。

A.空白對(duì)照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.3 磷酸化AMPK的表達(dá)

由圖3可知，F(xiàn)EA預(yù)處理RAW264.72 h后，LPS組與空白組相比p-AMPKα/AMPKα的蛋白表達(dá)比值無(wú)顯著差異；FEA處理組與LPS組相比，80 μg/mL的FEA能顯著增加p-AMPKα/AMPKα的比值。FEA預(yù)處理RAW264.74 h后，LPS組與空白組相比，p-AMPKα/AMPKα的蛋白表達(dá)比值顯著降低，F(xiàn)EA處理組與LPS組相比，40 μg/mL和80 μg/mL 的FEA能極顯著增加p-AMPKα/AMPKα的比值。表明FEA預(yù)處理能顯著增加LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化AMPK的表達(dá)水平。

A.空白對(duì)照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.4 磷酸化ERK的表達(dá)

由圖4可知，與空白組相比，LPS刺激2 h后模型組的p-ERK/ERK水平均極顯著升高。分別用40 μg/mL和80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h后能極顯著抑制p-ERK/ERK水平。用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后，極顯著增加了p-ERK/ERK水平。表明FEA預(yù)處理2 h能極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化ERK的表達(dá)。

A.空白對(duì)照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.5 磷酸化P38的表達(dá)

由圖5可知，與空白組相比，LPS刺激2 h后，模型組的p-P38/P38水平有所升高，但差異不顯著。分別用40 μg/mL和80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h后增加了p-p38/p38水平，但差異仍然不顯著。分別用40 μg/mL和80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后，能極顯著降低p-p38/p38水平。表明FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后，能極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)磷酸化P38的表達(dá)。

A.空白對(duì)照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.6 磷酸化JNK的表達(dá)

由圖6可知，與空白組相比，LPS刺激2 h后模型組p-JNK/JNK水平極顯著的升高，而用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h和4 h后均能極顯著抑制p-JNK/JNK水平。表明80 μg/mL FEA預(yù)處理后極顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化JNK的表達(dá)。

A.空白對(duì)照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.7 磷酸化c-Jun的表達(dá)

由圖7可知，與空白組相比，LPS刺激下2 h后模型組c-Jun磷酸化水平均極顯著升高，用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h后能降低磷酸化c-Jun的表達(dá)水平，但差異不顯著；用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后能極顯著抑制磷酸化c-Jun的表達(dá)水平。表明80 μg/mL的FEA預(yù)處理4 h后極顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化c-Jun的表達(dá)。

A.空白對(duì)照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

3 討論

辣蓼是我國(guó)分布較廣的一種傳統(tǒng)中草藥，具有祛風(fēng)利濕,散淤止痛,解毒消腫等功效。辣蓼全草的主要成分為鞣質(zhì)、黃酮類和揮發(fā)油，其中總黃酮部分是辣蓼發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗病毒作用的主要活性成分[10-12]。近年來(lái)有關(guān)辣蓼黃酮生物活性的研究較多，周淑棉等[13]為探究辣蓼黃酮正丁醇部分(FNB)體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PPRSV)的效果，采用不同濃度的FNB作用于PPRSV毒株感染的Marc-145細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，使用FNB處理后的藥物組細(xì)胞存活率顯著高于病毒組細(xì)胞，結(jié)果說(shuō)明不同濃度的FNB可以抑制PPRSV的大量繁殖，從而提高M(jìn)arc-145細(xì)胞的存活率，顯示出抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用。趙雅媚等[14]為探究總黃酮體外抗氧化活性，采用熱回流提取辣蓼總黃酮測(cè)定其對(duì)DPPH和羥基自由基的清除率后發(fā)現(xiàn)，辣蓼黃酮的濃度越高對(duì)DPPH和羥基自由基的清除率越高，證明辣蓼黃酮的抗氧化特性。辣蓼黃酮的抗炎效果也是近年來(lái)討論的焦點(diǎn)，由于目前臨床上治療炎癥的藥物對(duì)腎臟的損害很大，而辣蓼屬于天然藥物，在治療疾病時(shí)相較于人工合成的西藥副作用小，使用起來(lái)也更加安全[15-16]。前期已證實(shí)辣蓼黃酮正丁醇部分和乙酸乙酯部分具有良好的抗炎效果[3]，而有關(guān)于辣蓼黃酮乙酸乙酯部分抑制炎癥反應(yīng)分子機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

有研究表明[17]，人與小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中，激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)有助于提高抗炎藥物的作用，因此激活A(yù)MPK被認(rèn)定為炎癥進(jìn)程被抑制的標(biāo)志之一。炎癥相關(guān)試驗(yàn)中常以LPS誘導(dǎo)RAW264.7構(gòu)建炎癥模型，通過(guò)測(cè)定炎癥反應(yīng)中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平推斷該炎癥反應(yīng)中的分子機(jī)制。有研究表明，當(dāng)LPS刺激RAW264.7構(gòu)建炎癥模型后，LPS會(huì)激活MAPK通路中的p38、ERK與JNK。這3個(gè)MAPK亞基的激活導(dǎo)致iNOS和COX-2蛋白的高表達(dá)[18]。再者p38、ERK與JNK的激活直接或間接的使Elk-1,c-Jun以及ATF-1磷酸化[19]?；罨腏NK分子會(huì)磷酸化c-Jun的ser63和ser73位點(diǎn)并激活c-Jun[20]。通過(guò)LPS刺激RAW264.7構(gòu)建炎癥模型，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)和相關(guān)蛋白磷酸化水平即可判斷該炎癥反應(yīng)可能的分子機(jī)制。

本試驗(yàn)為探究辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)對(duì)炎性反應(yīng)干預(yù)的分子機(jī)制，采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7構(gòu)建炎癥模型，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2的表達(dá)水平，以及AMPK、ERK、P38、JNK、c-Jun及其相應(yīng)蛋白磷酸化水平，從而推斷可能的干預(yù)機(jī)制。結(jié)果表明，在一定給藥劑量或是孵育時(shí)間的情況下，F(xiàn)EA預(yù)處理均能抑制LPS誘導(dǎo)的p38、ERK與JNK的磷酸化，從而減緩細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。其中80 μg/mL的FEA預(yù)處理抑制LPS誘導(dǎo)的JNK的磷酸化效果更好，F(xiàn)EA預(yù)處理孵育2 h能抑制LPS誘導(dǎo)的ERK磷酸化效果更好。試驗(yàn)還表明，F(xiàn)EA不僅能抑制MAPK家族JNK的磷酸化，還能抑制JNK的反應(yīng)底物c-Jun的磷酸化，這也許是FEA抗炎活性的主要作用靶點(diǎn)之一。

綜上所述，辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7具有抗炎作用，其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)iNOS與COX-2蛋白的高表達(dá)、抑制MAPKs信號(hào)通路p38、ERK與JNK的磷酸化和增加磷酸化AMPK的表達(dá)水平有關(guān)。