陳婷婷，達(dá)舉云，申玉龍，門倩云，李宗帥，王媛媛，楊孝樸，張 勇，趙興緒

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

奶牛乳房炎(cow mastitis)是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中較為常見的一種普通病，被認(rèn)為是世界上“最昂貴”的奶牛疾病之一。它通常由多種病原微生物引起，而金黃色葡萄球菌是該病最主要的致病菌之一[1]。近來(lái)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)感染誘發(fā)了嚴(yán)重的臨床醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。有研究報(bào)道表明，牛的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染率在美國(guó)和韓國(guó)較低(分別為4%和4.2%)，但中國(guó)牛的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染率較高(47.6%)[3]。目前，抗生素仍然是治療奶牛乳房炎的主要方法。然而，隨著抗生素的不合理使用導(dǎo)致奶牛乳房炎病原菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”[4]。 由MRSA菌株引起的感染對(duì)青霉素、苯唑西林等主要種類的抗生素具有耐藥性，這使得治療時(shí)間延長(zhǎng)或治療效果甚微。細(xì)菌致病力的強(qiáng)弱與其分泌的多種毒力因子密切相關(guān)，S.aureus也不例外。常見的毒力因子包括細(xì)菌毒素(腸毒素、溶血素、殺白細(xì)胞素和脫皮毒素等外毒素)、黏附蛋白(黏附素)、細(xì)胞表面碳水化合物和保護(hù)細(xì)菌的蛋白質(zhì)(凝固酶)及可能有助于細(xì)菌致病性的水解酶(耐熱核酸酶)等葡萄球菌酶[5]。研究病原菌的毒力因子，對(duì)于了解病原菌和宿主之間的相互作用有非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)試驗(yàn)數(shù)據(jù)便于保存，可用于大規(guī)模和長(zhǎng)期的流行病學(xué)監(jiān)控[6]。故而，本研究選擇以甘肅省東、中和西部為代表的3個(gè)地區(qū)罹患臨床型乳房炎41頭奶牛93個(gè)乳樣為樣本，進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定、MRSA的篩選及耐藥性分析，同時(shí)對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行MLST分析并且檢測(cè)其毒力因子的強(qiáng)弱，以期了解甘肅省臨床型奶牛乳房炎感染金黃色葡萄球菌分子MRSA流行情況、耐藥特點(diǎn)與分布規(guī)律及其毒力基因的攜帶狀況，為甘肅省臨床型奶牛乳房炎的防治和亞單位基因疫苗的研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 依據(jù)奶牛乳房的外觀和牛場(chǎng)工作人員描述，采集甘肅省41頭罹患臨床型乳房炎奶牛的乳樣共計(jì)93份，4 ℃或-20 ℃保存。其中，甘肅東南地區(qū)(隴東南)天水市24份(樣品名為T1-T24)，甘肅中部地區(qū)(隴中)定西市22份(樣品名為D1-D22)，甘肅西部地區(qū)(河西)張掖市47份(樣品名為Z1-Z47)。

1.1.2 主要試劑 Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、亞碲酸鹽卵黃增菌液、Mueller Hinton瓊脂培養(yǎng)基(MHA)、青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、OMEGA公司產(chǎn)品；微量生化鑒定管、藥敏片、杭州濱河微生物公司產(chǎn)品；ATCC29213質(zhì)控菌株、北京質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×EasyTaqPCR SuperMIX、DNA Marker北京全式金公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)(1300 SERIES A2)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9160B)，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；正置光學(xué)顯微鏡(CX23)，日本Olympus公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(T100)、凝膠成像系統(tǒng)(Universal HoodⅡ)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌分離 乳樣充分搖勻，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，涂片、革蘭氏染色、鏡檢后接種于Baird-Parker氏瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，置-80℃保存。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 生化試驗(yàn) 按照微量生化反應(yīng)管說(shuō)明書進(jìn)行接觸酶、凝固酶、糖分解、甘露醇和硝酸鹽試驗(yàn)。結(jié)果依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)比，判定細(xì)菌的種屬。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 按照DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取待檢菌基因組，采用侯書寶設(shè)計(jì)的引物[7]，利用PCR擴(kuò)增16S rRNA序列，產(chǎn)物送北京奧科鼎盛有限公司測(cè)序，結(jié)果進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析。

1.3 MRSA篩選

根據(jù)GenBank(登錄號(hào)：AP017922.1)中已公布的基因序列，利用premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增mecA基因的PCR引物，上游引物F:5′-ATGAGAATAGAACGAGTAGATGA-3′；下游引物R:5′-CAAACTCTGTAGTTATTGGATTG-3′，預(yù)期擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為502 bp。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)

采用瓊脂紙片擴(kuò)散法(K-B法)，將新鮮菌懸液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫?37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》判斷對(duì)藥物的敏感性，金黃色葡萄球菌(ATCC29213)作為質(zhì)控菌。

1.5 MLST分型

1.5.1 PCR擴(kuò)增 參照金黃色葡萄球菌MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubMLST.org/aureus/)所提供的arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL7對(duì)持家基因的引物序列，擴(kuò)增目的片段。

1.5.2 測(cè)序及MLST分型分析 將產(chǎn)物送金唯智(天津)公司測(cè)序。登錄金黃色葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(pubMLST)，對(duì)每株菌的7個(gè)持家基因序列進(jìn)行查詢與比對(duì)，得到相應(yīng)的等位基因編碼(aelle)，按照arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL的排列順序，確定菌株的序列型(sequence type，ST)。

1.5.3 進(jìn)化樹分析 將測(cè)得的不同等位基因序列分別通過(guò)Clustal進(jìn)行對(duì)位分析，7個(gè)基因串聯(lián)后采用NJ(Neighbor-joining)法進(jìn)行Bootstrap 2 000次的重復(fù)構(gòu)建，使用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹圖形繪制。

1.6 毒力基因檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[8]，用PCR技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌14種毒力基因在分離株中的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

從93份乳樣中分離得到40株葡萄球菌，其中表皮葡萄球菌1株(D4)，溶血葡萄球菌4株(Z7、Z14、D13和T2)，木糖葡萄球菌1株(Z9)，腐生葡萄球菌5株(T1、T9、D3、D12和Z17)，偽中間葡萄球菌1株(T11)，金黃色葡萄球菌28株，分離率為30%。對(duì)28株金黃色葡萄球菌重新編號(hào)，其中張掖市13(Y1-13)株、定西市5(X1-5)株、天水市10(Q1-10)株；3個(gè)地區(qū)金黃色葡萄球菌的分離率依次為46.42%、17.86%和35.71%。

2.2 MRSA篩選

mecA基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1?？梢?8株金黃色葡萄球菌中有11株mecA基因陽(yáng)性，確定為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，檢出率為39.3%。其中張掖、天水和定西地區(qū)mecA基因陽(yáng)性檢出結(jié)果分別為6株、4株和1株，檢出率依次為46%、40%和20%。其余17株mecA基因陰性，為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)，檢出率為60.71%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～11.Y1、Y2、Y4、Y6、Y8、Y12、Q6、Q7、Q8、Q10、X2

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

28株金黃色葡萄球菌對(duì)12種抗生素的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表1。11株MRSA和17株MSSA均對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，MRSA對(duì)四環(huán)素、克林霉素、多黏菌素B、氯霉素、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、氨曲南等的敏感率均低于MSSA；分離株多為多重耐藥(16株)，多重耐藥率達(dá)到57.14%。

表1 28株金黃色葡萄球菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 MLST分型

2.4.1 MLST分析 應(yīng)用PCR方法成功擴(kuò)增出28株金黃色葡萄球的7個(gè)管家基因(圖2)，經(jīng)測(cè)序后獲得基因的部分保守序列(2株多次送測(cè)失敗)，其余26株的測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的相應(yīng)管家基因進(jìn)行比對(duì)分析，共有9個(gè)型(表2，圖3)。其中ST59有8株(6株是MRSA，2株是MSSA),是其優(yōu)勢(shì)型，占31%；ST50和ST398(4株是MRSA，1株是MSSA)各5株；ST3796和ST5323各有2株，其余序列型均只有1株。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 700; 1～7:arcC、aroE、glpF、gmk、pta、yqiL、tpi

表2 金黃色葡萄球菌等位基因編號(hào)及序列號(hào)

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過(guò)將MLST分型方法使用的7個(gè)持家基因測(cè)序的結(jié)果串聯(lián)后，對(duì)26株金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹有兩大分支Group1和Group2，其中定西市的4株全部在Group1中，說(shuō)明其不存在地區(qū)差異性，而天水和張掖地區(qū)的在Group1分支上的分離株多于Group2分支上的，體現(xiàn)出這兩個(gè)地區(qū)的金黃色葡萄球菌存在地區(qū)性差異。

圖3 ST分型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.5 毒力基因檢測(cè)

28株金黃色葡萄球菌毒力基因的PCR檢測(cè)結(jié)果見表3。對(duì)28株分離菌進(jìn)行了14種毒力基因檢測(cè)，檢出了12種(圖4)，但有2種，即hla和FnBPB未被檢出。其中nuc、spa和coa檢出率均為100%，且在MRSA和MSSA中檢出的結(jié)果一致；hlb、set1、clfA、sak、seb、FnBPA、seg、PVL和sea在MSSA菌株的陽(yáng)性檢出率分別為88.2%、76.5%、70.6%、35.3%、58.8%、88.2%、23.5%、11.8%和23.5%，而在MRSA菌株中依次為63.6%、63.6%、54.5%、18.1%、45.5%、72.7%、9.1%、18.2%和18.1%。這些基因在張掖市分離株中檢出11種，而定西和天水市分別檢出8和9種。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～14.FnBPA、sak、seb、PVL、nuc、sea、spa、hlb、clfA、set1、seg、coa、hla、FnBPBM.DNA Marker DL 2 000; 1-14.FnBPA,sak,seb,PVL,nuc,sea,spa,hlb,clfA,set1,seg,coa,hla,FnBPB

表3 牛源金黃色葡萄球菌毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

奶牛乳房炎是奶牛生產(chǎn)中最常見、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的普通病之一，它是由多種病原微生物感染引起的，已知的奶牛乳房炎的致病微生物已超過(guò)150種，其中包括球菌、桿菌、支原體、真菌、酵母菌和病毒等。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌(S.aureus)是引起奶牛乳房炎的諸多致病菌中最重要病原菌之一[9]，也是臨床上最難治愈并造成經(jīng)濟(jì)損失最大的接觸性傳染性病原[10]。本試驗(yàn)從93份乳樣中分離到6種40株葡萄球菌屬的細(xì)菌，其中金黃色葡萄球菌最多，占30%，這個(gè)結(jié)果低于郭慧琴等[11]對(duì)杭州地區(qū)金黃色葡萄球菌的分離率60.7%，但高于杜琳等[12]對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)、河北省、黑龍江省、上海市和山東省金黃色葡萄球菌分離率12.15%，這種分離率的地域差異性可能與牛場(chǎng)周邊的環(huán)境狀況、飼養(yǎng)條件以及管理水平有關(guān)。以往的研究表明，中國(guó)奶牛乳腺炎中MRSA的發(fā)生率在1.4%～47.6%[13]，在本試驗(yàn)中39.3%的金黃色葡萄球菌分離株被鑒定為MRSA，在國(guó)內(nèi)報(bào)道的范圍之內(nèi)。但是MRSA在德國(guó)、韓國(guó)、美國(guó)的流行率較低，分別為16.7%、6.3%、4%[14-16]。相比之下，在印度奶牛乳腺炎中檢測(cè)到MRSA的頻率更高，達(dá)到48.7%[3]。這可能與不同的樣本量、不同的季節(jié)、農(nóng)場(chǎng)管理和濫用抗生素有關(guān)。有研究顯示，100%的MRSA菌株對(duì)紅霉素、克林霉素、氯霉素和慶大霉素耐藥[17]，Vanderhagehen W等[18]報(bào)道了MRSA對(duì)四環(huán)素的抗藥性，經(jīng)常對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和氨基糖苷類產(chǎn)生抗藥性，并且Moon等[19]也報(bào)道了MRSA對(duì)青霉素存在較高的耐藥性。本研究中，MSSA和MRSA分離株的耐藥譜與相關(guān)報(bào)道中非常相似。在本試驗(yàn)中所分離的菌株均對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，說(shuō)明萬(wàn)古霉素可作為這三個(gè)地區(qū)治療金葡菌引起的臨床型奶牛乳房炎首選藥物。

為了進(jìn)一步研究分離株的致病性，本試驗(yàn)通過(guò)PCR檢測(cè)了14 種金黃色葡萄球菌常見的毒力基因的分布情況，結(jié)果顯示，MRSA 菌株對(duì)腸毒素基因seg、set1、sea、seb和sak的攜帶率較低，這與之前報(bào)道的MRSA 菌株較少攜帶腸毒素基因的研究結(jié)果一致[20-21]。此外，clfa、FnBPA、nuc、spa、coa、hlb、set1和seb等基因在分離株中的高頻率，顯示它們?cè)诟拭C牛乳房炎中的潛在毒力。含有pvl基因的金黃色葡萄球菌可能對(duì)人類和動(dòng)物造成危害，它們與嚴(yán)重的皮膚和軟組織感染有關(guān)[22]。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)4株pvl陽(yáng)性菌株(14.3%)，其中2株是MRSA ，這與Mancini F等[23]在意大利南部的牛奶和乳制品中鑒定出MRSA-pvl陽(yáng)性菌株型一致，與本研究不同的是Sudagidan M等[24]從食物中分離的金黃色葡萄球菌中存在MSSA-pvl分離株，說(shuō)明MSSA-pvl分離株不僅存在于食物源金黃色葡萄球菌中，也存在于動(dòng)物源金黃色葡萄球菌中。通過(guò)MLST分型發(fā)現(xiàn)，26株金黃色葡萄球菌中存在9種ST序列型，其中ST59為優(yōu)勢(shì)序列型。MRSA 菌株存在ST59、ST398和ST1965這3種序列型，有研究報(bào)道瑞士和比利時(shí)乳房炎奶牛乳汁中的MRSA屬于ST398，但也有在法國(guó)和北美ST398克隆株引起人類嚴(yán)重感染的報(bào)道[25-26]。因此，ST398序列型的菌株應(yīng)值得注意，可能存在人和動(dòng)物之間相互傳播的可能性，應(yīng)避免在養(yǎng)殖過(guò)程中引起人和動(dòng)物的感染。MSSA菌株有8種序列型，其中以ST50為主，占 29.4%，與MRSA菌株相比表現(xiàn)出了克隆多樣性。