韓水仲，陳凌燕，白晨雨，王同燕，黃玉欣，宋歡歡，張浩浩，石 晶，鄧均華*，田克恭*

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471000；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽 471000；3.長春西諾生物科技有限公司，吉林長春 130000)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)、巴氏桿菌病(Paseurellosis)及產(chǎn)氣莢膜梭菌病(Clostridiumperferingensdisease)是危害養(yǎng)兔業(yè)最嚴(yán)重的3種急性傳染病，3種病的病原分別為兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，Cp)。目前，預(yù)防上述3種傳染病主要依靠疫苗免疫。由于缺乏培養(yǎng)兔出血癥病毒的敏感細(xì)胞系，傳統(tǒng)上，RHD的預(yù)防主要依靠組織滅活疫苗[1]。但是，RHDV組織滅活疫苗生產(chǎn)具有以下缺陷：首先，組織滅活疫苗的生產(chǎn)需要使用未接種疫苗的敏感兔，而敏感兔不易獲得且質(zhì)量具有不確定性；其次，疫苗生產(chǎn)需使用RHDV強(qiáng)毒感染兔，需要配備負(fù)壓動(dòng)物房以及專門的GMP生產(chǎn)線，不利于大規(guī)模生產(chǎn)且存在潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)；再者，由于用兔增殖活毒，存在動(dòng)物倫理與福利問題。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過基因工程手段構(gòu)建可表達(dá)有效蛋白以用于動(dòng)物疫病預(yù)防的亞單位疫苗產(chǎn)品逐漸增多，相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗，亞單位疫苗具有生產(chǎn)成本低，有效抗原含量高等優(yōu)點(diǎn)。因此，用基因工程技術(shù)研發(fā)RHD亞單位疫苗成為趨勢(shì)。目前國內(nèi)經(jīng)批準(zhǔn)的利用重組VP60蛋白預(yù)防RHDV的疫苗有江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所開發(fā)的“兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60株)”產(chǎn)品及普萊柯生物工程股份有限公司開發(fā)的“兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(RHDV-VP60株)”，但將其與多殺性巴氏桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合制備三聯(lián)疫苗用于預(yù)防傳染病尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究主要利用構(gòu)建的表達(dá)RHDV VP60蛋白病毒樣顆粒及實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的A型多殺性巴氏桿菌SC0512株及A型產(chǎn)氣莢膜梭菌LY株制備三聯(lián)滅活疫苗并對(duì)其進(jìn)行安全性及免疫效力評(píng)價(jià)，擬解決傳統(tǒng)RHDV組織滅活苗生產(chǎn)過程存在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)問題，實(shí)現(xiàn)29一針三防。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和毒株 表達(dá)兔出血癥病毒VP60蛋白病毒樣顆粒的重組桿狀病毒RHDV-VP60株、兔多殺性巴氏桿菌(A型)SC0512株、兔產(chǎn)氣莢膜梭菌(A型)LY株、兔出血癥病毒強(qiáng)毒HN株，國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心鑒定和保存。

1.1.2 主要試劑 SF-SFM昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，沃美生物公司產(chǎn)品；改良馬丁培養(yǎng)基、酪蛋白胨、酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甲醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；硫柳汞鈉，上海滬豐生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1.5 kg～3.0 kg健康易感兔，RHDV HI抗體效價(jià)低于1∶4，購自河南省康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；16 g～20 g Balb/c小白鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.4 主要儀器 生物反應(yīng)器(Celligen 115)，美國NBS公司產(chǎn)品；發(fā)酵罐(10JS-7000C)，上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組VP60蛋白病毒樣顆粒的制備 將重組桿狀病毒RHDV-VP60株按MOI=1的劑量接種在生物反應(yīng)器中長至2.0×106個(gè)/mL～2.5×106個(gè)/mL的Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)條件為27℃、80 r/min、DO 50%、pH6.5。培養(yǎng)96 h后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融后，離心去除細(xì)胞碎片，取樣測(cè)定其對(duì)1%人O型紅細(xì)胞的血凝效價(jià)，其余加入終濃度為0.5 g/L的甲醛溶液，充分混勻，37℃滅活24 h，測(cè)定滅活抗原的血凝效價(jià)。

1.2.2 兔多殺性巴氏桿菌菌液的制備 將兔多殺性巴氏桿菌SC0512株種子液按培養(yǎng)基總量的1%～2%接入，37℃、pH 7.0、DO 20%～30%條件下，采取流加補(bǔ)料法發(fā)酵培養(yǎng)18 h～24 h，收獲菌液，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，其余加入終濃度為1.5 g/L甲醛，充分混勻，37℃滅活24 h。

1.2.3 兔產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液的制備 兔產(chǎn)氣莢膜梭菌(A型)LY株按培養(yǎng)基總量的2.5%～5%接入，37℃、pH7.0、通入氮?dú)獗?.01 MPa、轉(zhuǎn)速100 r/min條件下，采取手動(dòng)補(bǔ)糖法發(fā)酵培養(yǎng)4 h～5 h，收獲菌液，取樣進(jìn)行毒素含量測(cè)定，其余加入終濃度為0.5 g/L的甲醛溶液，充分混勻，37℃滅活脫毒72 h。毒素含量用小鼠測(cè)定，將收獲的菌液離心過濾后，濾液用明膠緩沖液做不同梯度稀釋，分別接種小鼠，觀察24 h，根據(jù)小鼠死亡情況計(jì)算毒素含量。

1.2.4 三聯(lián)滅活疫苗的制備 按上述方法共制備3批抗原，并按下述方法混合后制備3批疫苗。用PBS(0.015 mol/L，pH 7.0)將重組兔出血癥病毒VP60蛋白液分別稀釋至血凝效價(jià)為1∶213，兔多殺性巴氏桿菌SC0512株菌液稀釋至1.0×1010CFU/mL，兔產(chǎn)氣莢膜梭菌(A型)LY株菌液稀釋至200個(gè)小鼠MLD/mL，然后分別按3∶11∶10進(jìn)行混合。將上述抗原混懸液與氫氧化鋁膠按4∶1的體積比混合，同時(shí)按總量的0.1 g/L加入硫柳汞，充分?jǐn)嚢杌靹颉?/p>

1.2.5 三聯(lián)苗的安全檢驗(yàn) 將3批疫苗分別經(jīng)皮下途徑接種5只健康易感兔，4.0 mL/只，接種后觀察14 d，每日觀察兔的精神、采食、飲水、糞便、體溫等。

1.2.6 三聯(lián)苗的最小免疫劑量測(cè)定 將3批疫苗分別以0.5 mL/只、1.0 mL/只、2.0 mL/只劑量經(jīng)皮下途徑注射1.5 kg～3.0 kg的健康易感兔，每個(gè)劑量免疫15只，同時(shí)設(shè)15只不免疫作為攻毒對(duì)照。

1.2.6.1 兔出血癥病毒HI抗體效價(jià)測(cè)定及攻毒 免疫后14 d，所有兔均通過耳緣靜脈采血，分離血清，使用8個(gè)血凝單位抗原測(cè)定血清中抗兔出血癥病毒HI抗體效價(jià)。將免疫兔及對(duì)照兔采血后轉(zhuǎn)至負(fù)壓強(qiáng)毒區(qū)，各皮下注射兔病毒性出血癥病毒HN株1.0 mL(含1000LD50)，攻毒后觀察7 d，統(tǒng)計(jì)各組兔的死亡率。

1.2.6.2 兔多殺性巴氏桿菌攻毒 免疫后21 d，取各劑量免疫兔及對(duì)照兔各5只轉(zhuǎn)至負(fù)壓強(qiáng)毒區(qū)，每只經(jīng)皮下接種兔多殺性巴氏桿菌菌液1 mL(含3～10 CFU/mL)，攻毒后觀察10 d，統(tǒng)計(jì)各組兔的死亡率。

1.2.6.3 兔產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒 免疫后21 d，取各劑量免疫兔及對(duì)照兔各5只，每只經(jīng)耳緣靜脈注射1個(gè)致死劑量的兔產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，攻毒后觀察7日，統(tǒng)計(jì)各組兔的死亡率。

1.2.7 三聯(lián)苗的免疫持續(xù)期試驗(yàn) 將3批疫苗以2.0 mL/只經(jīng)頸背部皮下注射1.5 kg～3.0 kg的健康易感兔，分別于免疫后0 d、14 d、21 d、30 d、90 d、180 d、210 d時(shí)，選擇5只免疫兔連同對(duì)照兔采血，用8個(gè)血凝單位抗原檢測(cè)其血清中抗兔出血癥病毒HI抗體效價(jià)，同時(shí)分別用兔出血癥病毒、多殺性巴氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素攻毒，統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)情況。

2 結(jié)果

2.1 三聯(lián)苗的制備

用重組桿狀病毒RHDV-VP60株制備的3批重組VP60蛋白液對(duì)1%人O型紅細(xì)胞的HA效價(jià)為1∶218～1∶219，滅活后HA效價(jià)為1∶217～1∶218。將蛋白和菌液滅活并檢驗(yàn)合格后，添加20%鋁膠佐劑混合均勻制備疫苗，共制備3批疫苗，批號(hào)20131201～20131203。

2.2 三聯(lián)苗的安全檢驗(yàn)

將3批疫苗分別經(jīng)頸背部皮下超劑量接種1.5 kg～3.0 kg的健康易感家兔5只，4.0 mL/只。接種后觀察14 d，接種兔精神、采食、飲水、糞便、體溫均無異常。

2.3 三聯(lián)苗最小免疫劑量測(cè)定

免疫后14日，0.5 mL/只劑量組免疫兔血清RHDV HI抗體效價(jià)為1∶8～1∶32，1.0 mL/只劑量組為1∶16～1∶64，2.0 mL/只劑量組為1∶32～1∶128(見圖1)；免疫后14 d，用兔出血癥病毒HN株攻毒，對(duì)照兔全部(5/5)死亡，0.5 mL/只劑量免疫組保護(hù)率60%～80%(3/5～4/5)，1.0 mL/只和2.0 mL/只劑量免疫組保護(hù)率100%(5/5)。免疫后21 d，用兔多殺性巴氏桿菌攻毒，對(duì)照兔全部(5/5)死亡，0.5 mL/只劑量免疫組保護(hù)率60%～80%(3/5～4/5)，1.0 mL/只劑量免疫組保護(hù)率80%～100%(4/5～5/5)，2.0 mL/只劑量免疫組保護(hù)率100%(5/5)；免疫后21 d，用兔產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素攻毒，對(duì)照兔全部(5/5)死亡，0.5 mL/只劑量免疫組保護(hù)率40%～60%(2/5～3/5)，1.0 mL/只劑量免疫組保護(hù)率80%～100%(4/5～5/5)，2.0 mL/只劑量免疫組保護(hù)率100%(5/5)(見表1)。

圖1 不同劑量免疫兔免疫14 d時(shí)血清中抗兔出血癥病毒HI抗體效價(jià)

表1 3批疫苗不同劑量免疫兔攻毒保護(hù)結(jié)果

2.4 三聯(lián)苗免疫持續(xù)期

疫苗免疫后不同時(shí)間測(cè)定兔血清中抗兔出血癥病毒HI抗體效價(jià)，免疫后14 d，血清HI效價(jià)為1∶16～1∶64；免疫后30 d，血清HI效價(jià)達(dá)到1∶64～1∶512，至免疫后210 d，血清HI效價(jià)為1∶16～1∶32(見圖2)。免疫后210 d攻毒，兔出血癥病毒HN株攻毒，對(duì)照兔80%(4/5)死亡，免疫兔全部(5/5)健活；用兔多殺性巴氏桿菌SC0512株和兔產(chǎn)氣莢膜梭菌LY株毒素攻毒，對(duì)照兔全部(5/5)死亡，免疫兔保護(hù)率80%(4/5)(見表2)。

圖2 3批疫苗免疫后不同時(shí)間兔血清抗兔出血癥病毒HI抗體效價(jià)

表2 疫苗免疫后不同時(shí)間攻毒保護(hù)結(jié)果

3 討論

目前用于重組蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸埃希氏菌、酵母、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)等。國內(nèi)外有報(bào)道使用上述三種表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)兔出血癥病毒VP60蛋白均取得良好的免疫保護(hù)效果[2-11]。本研究選擇桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用于兔出血癥病毒抗原的生產(chǎn)。相對(duì)于酵母和桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)，用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白缺少糖基化、翻譯后修飾等，使重組表達(dá)蛋白在生物活性上存在缺陷，表達(dá)的蛋白易出現(xiàn)包涵體[10]。雖然有報(bào)道將兔出血癥病毒VP60基因與β-半乳糖苷酶、SUMO等共表達(dá)可促進(jìn)可溶性表達(dá)，但去除該標(biāo)簽需經(jīng)過酶切和純化，不利于大規(guī)模生產(chǎn)[2-3]。用酵母表達(dá)重組蛋白，其表達(dá)的蛋白可組裝成病毒粒子，免疫原性良好，兔免疫后可抵抗兔出血癥病毒的感染，但由于成本等原因，在獸用生物制品應(yīng)用較少。用桿狀病毒表達(dá)重組蛋白，重組蛋白可溶性表達(dá)，蛋白活性高，更加便于產(chǎn)業(yè)化，且在獸醫(yī)上已開發(fā)出相應(yīng)的亞單位疫苗用于豬瘟、豬圓環(huán)病毒病等的預(yù)防。國內(nèi)外有報(bào)道用桿狀病毒表達(dá)重組VP60蛋白，但可能由于病毒株或表達(dá)系統(tǒng)不同，出現(xiàn)重組蛋白未形成病毒樣顆粒[6]。本研究所用的重組桿狀病毒RHDV-VP60株表達(dá)的VP60蛋白在細(xì)胞內(nèi)可折疊成病毒樣顆粒，電鏡下觀察，其形態(tài)同天然病毒相似，可最大限度保持天然病毒的生物活性(未發(fā)表資料)。桿狀病毒表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)量較低，是制約其規(guī)?；瘧?yīng)用的原因之一[9]。通過重組桿狀病毒感染家蠶，將家蠶處理后獲得重組蛋白雖然產(chǎn)量高，但可能存在質(zhì)量控制等問題，目前還未見規(guī)?；a(chǎn)[6，9，12]。國內(nèi)有報(bào)道構(gòu)建的重組桿狀病毒表達(dá)的VP60蛋白含量為1∶212～1∶213[11，13]。本研究所用重組桿狀病毒表達(dá)的VP60蛋白含量不低于1∶218，與文獻(xiàn)報(bào)道相比，表達(dá)量至少提高了32倍，且免疫效果良好，節(jié)約了生產(chǎn)成本，便于規(guī)模化生產(chǎn)。

兔產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的保護(hù)效果與其疫苗中類毒素的含量呈正相關(guān)[14]。用產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素制備的疫苗免疫動(dòng)物也可獲得良好的保護(hù)效果[15]。雖然通過濃縮可提高毒素含量，但這無疑增加了企業(yè)生產(chǎn)成本[16-17]。為提高發(fā)酵菌液中毒素的含量，適宜的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件至關(guān)重要。本研究通過系列篩選，篩選出一種適宜產(chǎn)氣莢膜梭菌LY株生長的培養(yǎng)基，收獲的發(fā)酵菌液中，其毒素含量不低于400 MLD/mL，顯著高于《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)及其他研究者報(bào)道[17-18]。

總之，本研究開發(fā)的兔三聯(lián)滅活疫苗生產(chǎn)成本低，易規(guī)模化生產(chǎn)，免疫效果確實(shí)，解決了傳統(tǒng)RHDV組織滅活苗生產(chǎn)過程存在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)問題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了一針三防。