姚燦坤，牟雷，張?zhí)旆?，唐新?/p>

廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院 廣東深圳 518034

近10年來，2型糖尿病引發(fā)的以動(dòng)脈粥樣硬化為代表的心血管并發(fā)癥的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷上升，成為2型糖尿病患者最常見的死因，嚴(yán)重危害了人類健康[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，超過50%的糖尿病患者最終將死于糖尿病的大血管病變[2]。

糖尿病是心血管系統(tǒng)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高血糖狀態(tài)下可刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)與炎癥反應(yīng)，加快動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[3]，從而導(dǎo)致糖尿病血管病變，糖尿病血管病變是導(dǎo)致糖尿病致死、致殘的主要原因。雖然糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制目前還未清楚，但是可以明確的是動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病合并血管病變的病理基礎(chǔ)。中醫(yī)藥在糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防及治療上具有副作用少、療效確切等優(yōu)勢(shì)[4-5]，其研究成果已被2017版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》采用并推薦防治糖尿病及其并發(fā)癥。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B （PI3K/Akt）信號(hào)通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管形成、能量代謝等多種機(jī)制調(diào)控心血管功能，與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[6-7]。

冠心通絡(luò)方為廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院心血管病科的協(xié)定處方，臨床應(yīng)用效果良好，無不良反應(yīng)，是以補(bǔ)陽還五湯為基礎(chǔ)方加減而來，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明具有活血通絡(luò)的補(bǔ)陽還五湯可以通過降糖、調(diào)脂、減輕炎癥、改善氧化應(yīng)激等對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥硬化具有一定的防治作用[8-9]。本研究擬通過觀察冠心通絡(luò)方對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及主動(dòng)脈組織中PI3K/Akt蛋白表達(dá)的影響，試探討冠心通絡(luò)方對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

材料與儀器

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

63只雄性SD大鼠（300±20）g，購買于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（粵）2013-0034。飼養(yǎng)條件:廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食飲水，人工照明，明暗交替12h/12h，室溫22～24度，相對(duì)濕度67%，通風(fēng)良好。

2 藥物與試劑

冠心通絡(luò)方（黃芪30g，白參10g，麥冬15g，葛根30g，丹參15g，赤芍10g，紅花10g，瓜蔞殼30g，地龍10g，甘草5g）由廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院中藥房提供。阿托伐他汀鈣片鈣10mg/片（美國(guó)輝瑞制藥有限公司，批號(hào)H20051408）。鏈脲佐菌素（STZ），美國(guó)Sigma；檸檬酸鈉緩沖液，北京雷根生物技術(shù)有限公司；PI3K-1小鼠單克隆抗體、Akt-1兔多克隆抗體，英國(guó)Ab-cam公司；BCA法蛋白含量檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司；大鼠C反應(yīng)蛋白試劑盒、白細(xì)胞介素6試劑盒，上海華壹生物科技有限公司。

3 方法

3.1 動(dòng)物造模分組及給藥 63只雄性SD大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組11只和造模組52只。正常對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料；造模組采用高糖高脂飼料+灌胃高糖高脂乳+飲用蔗糖水的方法聯(lián)合喂養(yǎng)6周。7周后若體質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)者為食源性肥胖大鼠，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行造模，其余淘汰，共有50只大鼠符合食源性肥胖標(biāo)準(zhǔn)。禁食12h后，造模組大鼠一次性小劑量（28mg/kg）腹腔注射STZ，正常對(duì)照組腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液，各組以原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第12周后經(jīng)尾尖端采血測(cè)空腹血糖，若空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多飲、多尿、多食現(xiàn)象確定為糖尿病模型大鼠，共有45只入組。將入組大鼠隨機(jī)分為模型組、冠心通絡(luò)方組和阿托伐他汀鈣片組各15只。冠心通絡(luò)方組大鼠給予冠心通絡(luò)方溶液17.325g/kg灌胃，阿托伐他汀鈣片組大鼠給予阿托伐他汀鈣片水溶液1.05mg/kg灌胃。藥物干預(yù)一共12周。

3.2 一般情況 每天觀察大鼠活動(dòng)及精神狀態(tài)、毛色、飲食、二便等情況。

3.3 血液采集和標(biāo)本制備 末次給藥后禁食12h，腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，PBS灌注完畢后迅速處死大鼠取出主動(dòng)脈，冰鹽水沖洗后放入10%中性甲醛固定，其余部分組織放入-80℃冰箱中保存。

3.4 血生化指標(biāo)測(cè)定 使用生化分析儀檢測(cè)空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白；使用ELISA試劑盒檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白、IL-6；使用生化試劑盒檢測(cè)丙二醇、超氧化物歧化酶，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作。

3.5 Westernblot 分別取主動(dòng)脈組織50mg 加入0.5ml PIPA裂解液提取組織總蛋白，用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配置SDS聚丙稀酰胺凝膠。每個(gè)樣品上樣20ug，恒流300mA轉(zhuǎn)膜60min，放入5%封閉液中封閉1h，洗膜5min，將膜分別加入一抗PI3K-1（1:1000）和Akt-1（1:1000），4℃ 孵育過夜，洗膜3次，每次10min。再將膜放入相應(yīng)二抗溶液的自封袋中，搖床上搖動(dòng)50min，洗膜3次，每次10min。在暗室中用ECL試劑盒發(fā)光顯影，Geo-Pro軟件分析相關(guān)條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠一般狀況

正常組大鼠行動(dòng)活躍，精神狀態(tài)良好，毛色有光澤，攝食量、飲水量、體質(zhì)量均正常；模型組、冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組大鼠反應(yīng)遲鈍，精神萎靡不振，毛色暗黃無光澤，攝食量、飲水量明顯增多，體質(zhì)量減輕，符合糖尿病“三多一少”的特征；與模型組相比，冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組大鼠一般狀況有一定程度的改善。

2 各組大鼠血糖比較情況

對(duì)于血糖的影響，與空白組相比，模型組、冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組，空腹血糖、糖化血紅蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，冠心通絡(luò)方組的空腹血糖及糖化血紅蛋白下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組組間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3 各組大鼠炎癥指標(biāo)比較情況:

對(duì)于炎癥指標(biāo)的影響，與空白組相比，模型組、冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組的CRP及IL-6明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組的CRP及IL-6均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示冠心通絡(luò)方及阿托伐他汀鈣片均能改善2型糖尿病大鼠的炎癥反應(yīng)狀態(tài)。冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組組間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較情況:

對(duì)于氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，與空白組相比，模型組、冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組的SOD水平明顯下降、MDA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，冠心通絡(luò)方組、阿托伐他汀鈣片組SOD活性明顯上升，MDA水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示冠心通絡(luò)方及阿托伐他汀鈣片均能改善2型糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激水平。冠心通絡(luò)方組及阿托伐他汀鈣片組組間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血糖、氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)

5 各組大鼠PI3K/Akt蛋白表達(dá)比較情況:

與空白組比較，模型組、冠心通絡(luò)方組、阿托伐他汀鈣片組的主動(dòng)脈組織中PI3K的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，冠心通絡(luò)方組、阿托伐他汀鈣片組的主動(dòng)脈組織中PI3K的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而冠心通絡(luò)方組與阿托伐他汀鈣片組的主動(dòng)脈組織中PI3K的表達(dá)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

與空白組比較，模型組、冠心通絡(luò)方組、阿托伐他汀鈣片組的主動(dòng)脈組織中Akt的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，冠心通絡(luò)方組、阿托伐他汀鈣片組的主動(dòng)脈組織中Akt的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而冠心通絡(luò)方組與阿托伐他汀鈣片組的主動(dòng)脈組織中Akt的表達(dá)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠PI3K/Akt指標(biāo)。

討論

糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)下，會(huì)逐漸引起血管壁增厚、管腔變窄、管腔閉塞，甚至導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生。高血糖環(huán)境下會(huì)誘發(fā)體內(nèi)氧化應(yīng)激亢進(jìn)、抗氧化能力下降，致使活性氧在體內(nèi)大量蓄積，從而導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷，引起小動(dòng)脈纖維病變、動(dòng)脈硬化[10]。此外，糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化經(jīng)研究證實(shí)是炎癥性疾病[11]，糖尿病患者血管壁存在持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)，釋放多種炎癥因子直接損傷血管內(nèi)皮，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)三者互為影響，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，共同參與了糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程。

PI3K/Akt 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的生存通路之一，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程[12]。PI3K/Akt 信號(hào)通路的活化可以促進(jìn)組織對(duì)葡萄糖的攝取，減弱胰島素抵抗，此外還可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等[13]。在高糖導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理中，Akt起主要作用，Akt是PI3K信號(hào)通路下游的重要蛋白，PI3K/Akt 信號(hào)通路廣泛參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程，包括平滑肌細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞聚集等[14]。PI3K/Akt 信號(hào)通路在高血糖情況下可受到抑制，從而促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡，而維持該通路活化，可改善高葡萄糖造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[15-16]。據(jù)此推測(cè)PI3K/Akt通路可能通過調(diào)控炎癥及氧化應(yīng)激對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)揮作用。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)把糖尿病血管病變歸屬于消渴病的兼證，中醫(yī)理論認(rèn)為，糖尿病血管病變?cè)谂R床上多以胸悶、胸痛為主癥，其病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，本虛是以氣陰兩虛為主，標(biāo)實(shí)則以絡(luò)阻血瘀多見，臨床調(diào)查也發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛夾瘀證是糖尿病血管病變的主要證型，所占比例高達(dá)80%以上[17]，因此氣陰兩虛、絡(luò)阻血瘀是糖尿病血管病變的基本病機(jī)、核心病機(jī)。治療原則以益氣養(yǎng)陰，活血化瘀為法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都表明以“益氣養(yǎng)陰、活血化瘀”的中藥復(fù)方可以延緩糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，可明顯緩解患者臨床癥狀、改善預(yù)后、無嚴(yán)重不良反應(yīng)，對(duì)糖尿病血管病變病變具有防治作用[18-19]。

冠心通絡(luò)方是我院研制已應(yīng)用于臨床多年的中藥制劑，根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典名方補(bǔ)陽還五湯化裁而來，用于冠心病心絞痛的治療，該方以黃芪、白參為君藥，重用黃芪大補(bǔ)脾胃之元?dú)?，加用白參更加彰顯補(bǔ)氣益氣之功，氣行則血行；麥冬、葛根為臣藥，養(yǎng)陰增液、生津止渴；丹參、赤芍、地龍、紅花、瓜蔞為佐藥，活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)；甘草為使藥，調(diào)和諸藥。全方標(biāo)本兼治，補(bǔ)而不滯，化瘀而不傷正，有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功，契合糖尿病血管病變“氣陰兩虛、絡(luò)阻血瘀”的病機(jī)。在前期的研究中[20]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)冠心通絡(luò)方可以擴(kuò)張冠狀血管，抑制血小板聚集、粘附，降低主動(dòng)脈組織MCP-1、PKC-α表達(dá)，抑制炎癥增殖，減輕血管內(nèi)膜增生和血管平滑肌增殖等，從而防止血管再狹窄，提示該方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有一定的防治作用。

研究表明糖化血紅蛋白每增加1%，發(fā)生心血管疾病的相對(duì)危險(xiǎn)度增加18%，從而提示糖化血紅蛋白與糖尿病血管病變密切相關(guān)。SOD和MDA是常用反映氧化應(yīng)激的指標(biāo)，SOD活性下降會(huì)導(dǎo)致氧自由基代謝產(chǎn)物在體內(nèi)堆積，MDA含量高低則可間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，二者能較為客觀的反應(yīng)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。糖尿病血管病變時(shí)炎癥因子反應(yīng)活躍，糖尿病患者中CRP水平明顯升高，其是糖尿病血管病變的致病因子與預(yù)測(cè)因子，IL-6能促進(jìn)其他炎癥因子的釋放，其水平的變化可以反應(yīng)動(dòng)脈壁的受損程度。從本研究中可以看到，經(jīng)冠心通絡(luò)方干預(yù)12周后，可以明顯降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、CRP、IL-6、MDA的水平，提高SOD水平，提示冠心通絡(luò)方可以降糖，抑制氧化應(yīng)激損傷，減少炎癥反應(yīng)。冠心通絡(luò)方中黃芪、白參、葛根、紅花、赤芍等經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)具有降糖、清除氧自由基、抗炎等作用。經(jīng)冠心通絡(luò)方治療后，可提高糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織中PI3K/Akt蛋白的表達(dá)，從而推測(cè)其抑制或延緩2型糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制與提高主動(dòng)脈組織中PI3K/Akt蛋白的表達(dá)相關(guān)，從而發(fā)揮了降糖、改善氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的作用。

不過，本實(shí)驗(yàn)的樣本量小，且對(duì)機(jī)制的研究較為表淺，PI3K/Akt通路是多種通路互相交聯(lián)的樞紐，對(duì)該通路的調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚，需要更大樣本量的研究進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。