李丹陽,張曉花,劉靈芝,孫紅正，李俊周，彭 廷，張 靜，杜彥修,趙全志

(河南農業(yè)大學 農學院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省水稻生物學重點實驗室，河南 鄭州 450046)

水稻(Oryzasativa)是我國重要的糧食作物，60%的人口以稻米為口糧。因此，水稻的穩(wěn)產和增產對保障我國糧食安全具有重要意義。水稻的穩(wěn)產和增產主要靠“良種良法”，而化肥的合理使用是“良法”的必然措施。我國農業(yè)生產中存在化肥施用過量的問題，導致資源浪費和環(huán)境污染。因此，尋找作物營養(yǎng)元素高效吸收利用基因以降低化肥施用量，一直是農業(yè)科學家關注的熱點。

磷在水稻生長發(fā)育中起著重要作用，是生物膜、核酸和蛋白質的重要成分，參與能量代謝、物質合成、信號響應和轉導等過程[1]。我國近2/3 的耕地缺磷，需要施用磷肥維持和提高作物產量[2-3]。我國水稻生產上磷肥施用量較高且利用率低，地表徑流損失是稻田磷素流失的主要途徑[4]。鑒定磷高效吸收利用相關基因，提高水稻對磷的吸收利用率是解決磷肥浪費的重要手段。目前，已從水稻中鑒定了多個磷吸收、轉運及調控相關基因[5-7]。植物從土壤吸收無機磷主要由PHT1 (Phosphate transporter 1)家族負責[5]。水稻中有 13 個PHT1成員(OsPHT1;1—OsPHT1;13)[6]，除了具有吸收磷的功能外,部分PHT1成員還具有磷的運輸功能，例如OsPHT1;2、OsPHT1;3、OsPHT1;6和OsPHT1;8都具有將磷從根向莖運輸的功能[7]。磷從根向莖的長距離運輸主要由含SPX結構域的磷轉運蛋白家族負責，在水稻中有6個SPX亞家族蛋白OsSPX1—OsSPX6和3個SPX-EMS家族蛋白OsPHO1;1、OsPHO1;2和OsPHO1;3[8-9]。植物對缺磷信號的響應受多種轉錄因子的調控，包括PHR(Phosphate response)、WRKY、MYB (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)和bHLH(Basic helix-loop-helix protein)家族等[10-12]。其中,OsPHR1和OsPHR2通過調節(jié)磷饑餓誘導基因的表達而參與磷饑餓信號通路[10]。研究發(fā)現，光敏色素感知紅光和遠紅光，通過其下游的光敏色素互作因子(Phytochrome interacting factor,PIF)調控種子萌發(fā)、形態(tài)建成、避蔭反應、誘導開花和生物節(jié)律等生命活動[13-15]。擬南芥中有5個光敏色素基因(PHYA—PHYE)、至少8個PIF基因(PIF1—PIF8)[16-19]。進一步研究發(fā)現，擬南芥phyB突變體磷吸收降低，并揭示了PHYB通過PIF4/PIF5 和HY5(Long hypocotyl 5)調節(jié)磷饑餓響應基因PHT1和PHL1(PHR1-like 1)，進而調控磷吸收[20]。水稻中有6個PIL(Phytochrome interacting factors-like)基因(OsPIL11—OsPIL16)，調控水稻抽穗、籽粒大小、葉綠素合成、衰老、鹽和冷脅迫響應等[21-26]，但水稻PIL對磷吸收利用的影響研究還未見報道。另外，植物對氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饑餓時會影響植物對氮的吸收[28]。為此，以Ospil15突變體為材料，研究正常磷和低磷條件下OsPIL15基因對磷吸收利用的影響，并進一步分析OsPIL15基因對氮吸收利用的影響，以期為解析OsPIL15基因調節(jié)磷、氮吸收利用的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

本研究使用的水稻材料為日本晴(Nipponbare,Nip)和Ospil15突變體。Ospil15突變體是以日本晴為背景，利用CRISPR/Cas9技術獲得的敲除突變體的T8材料。

1.2 OsPIL15基因在低磷脅迫下的表達分析

登錄Transcriptome ENcyclopedia of Rice數據庫(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)，輸入OsPIL15轉錄本號進行查詢，獲得在正常和低磷脅迫下的OsPIL15基因表達量并進行分析。

1.3 材料培養(yǎng)及低磷脅迫處理

水稻材料在人工氣候室(光照2 000 lx、16 h、28 ℃/黑暗8 h、22 ℃)培養(yǎng)。挑選飽滿的水稻種子，用9%NaClO消毒10 min，自來水沖洗6次，蒸餾水洗5～6次，然后在28 ℃黑暗條件下置于無菌水中浸泡催芽2～3 d。將萌發(fā)一致的種子移到96孔板中，先用清水在人工氣候室培養(yǎng)7 d，然后采用Hoagland營養(yǎng)液進行磷處理，正常磷(Normal P，CK)處理濃度為300 μmol/L NaH2PO4，低磷(Low P，LP)脅迫處理濃度為10 μmol/L NaH2PO4。前3 d分別配制1/4、1/3、1/2Hoagland營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，此后采用Hoagland全濃度營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，營養(yǎng)液每2 d更換一次，培養(yǎng)至四葉一心時測定生物量和磷、氮含量。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 生物量 分別挑選正常磷與低磷脅迫處理的水稻植株各10株，用去離子水反復清洗根及葉表面，吸水紙吸干其表面水分，使用直尺測量地上部與根長度，隨后置于烘箱中，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質量，稱干質量。

1.4.2 磷、氮含量 將材料剪碎至粉末狀，混合均勻后稱取0.2 g樣品置于消煮管中，采用H2SO4-H2O2消煮法進行消煮，用去離子水將消煮液定容至50 mL，再用10 mm定量濾紙將其過濾至10 mL離心管中，使用AA3流動注射分析儀進行氮、磷含量測定，并計算磷和氮吸收效率、轉運系數、利用率。

吸收效率=單株磷或氮含量/單株根干質量×100%；

轉運系數=地上部磷或氮含量/根磷或氮含量；

利用率=單株氮或磷含量/單株干質量×100%。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫條件下OsPIL15基因表達分析

已報道擬南芥PHYB通過PIF4/PIF5 和HY5調節(jié)磷饑餓響應基因來調控磷的吸收[20]。為了研究水稻光敏色素互作因子基因OsPIL15在水稻中是否能夠調控磷的吸收，利用已有基因表達數據庫Transcriptome ENcyclopedia of Rice(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)提取OsPIL15基因在低磷脅迫(0 μmol/L NaH2PO4)下的表達量，然后進行分析。結果發(fā)現，低磷脅迫下，OsPIL15基因在水稻地上部的表達量下降，而在根中的表達量基本不變(圖1)，這表明OsPIL15基因響應磷脅迫，可能具有調節(jié)水稻磷吸收的功能。

2.2 OsPIL15基因對水稻生長的影響

由于OsPIL15基因受低磷脅迫誘導表達，故利用前期構建的敲除突變體材料Ospil15[26,29]，以野生型Nip為對照，設置正常磷(300 μmol/L)和低磷(10 μmol/L)2種磷濃度，研究低磷脅迫對Ospil15突變體和Nip生物量的影響。結果表明，低磷脅迫后Nip和Ospil15突變體的地上部長均降低，但是Nip降幅大于Ospil15突變體；低磷脅迫后，Nip根長變短，Ospil15突變體根長基本沒有變化(圖2a)。低磷脅迫后，Ospil15突變體和Nip的根、地上部干質量均降低，根干質量降低幅度小于地上部干質量(圖2b)。2個材料相比，低磷脅迫后Ospil15突變體與Nip地上部干質量降低幅度基本一樣，但Nip根干質量降低幅度(72.2%)大于Ospil15突變體(68.1%)。這表明低磷脅迫后Ospil15突變體的生長受影響較野生型小，特別是Ospil15突變體的根。

對低磷脅迫后的2個材料根長與地上部長的比值以及根干質量與地上部干質量的比值進行分析，發(fā)現低磷脅迫后根長/莖長、根干質量/地上部干質量均增大(圖2c、d)，這表明在低磷脅迫條件下水稻通過自身協(xié)調后更加側重了根的生長。

2.3 OsPIL15基因對水稻磷吸收轉運的影響

本研究測定了Ospil15突變體和Nip 2個材料中的磷含量來分析OsPIL15基因對水稻磷素吸收的影響。結果發(fā)現，在正常磷條件下，Ospil15突變體根中磷含量顯著大于Nip，Ospil15突變體地上部中磷含量大于Nip但不顯著(圖3a)。低磷脅迫條件下，2個材料單株磷含量均比正常磷條件下降低(圖3a、b)。低磷脅迫條件下，Ospil15突變體根中磷含量顯著高于Nip，地上部中磷含量顯著高于Nip(圖3b)。分析二者磷吸收效率發(fā)現，正常磷和低磷脅迫條件下Ospil15突變體磷吸收效率均大于Nip，低磷脅迫條件下增幅更大(圖3c)。綜上，無論是正常磷還是低磷脅迫條件下，Ospil15突變體磷含量和磷吸收效率均大于Nip，說明OsPIL15基因負調控水稻磷吸收，并且在低磷脅迫條件下OsPIL15基因對水稻磷吸收的負調控作用更強。

對Ospil15突變體和Nip的磷轉運系數進行分析發(fā)現，在正常磷條件下，Nip的磷轉運系數高于Ospil15突變體；在低磷脅迫條件下，Ospil15突變體的磷轉運系數大于Nip(圖3d)。這表明OsPIL15基因不僅影響水稻磷吸收，也調控磷從根向地上部的轉運。

2.4 OsPIL15基因對水稻氮吸收轉運的影響

氮是植物吸收的大量元素之一，植物對氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饑餓時會影響植物對氮的吸收[28]。因此，本研究分析了Ospil15突變體和Nip中的氮含量來研究OsPIL15基因是否調控氮吸收。結果發(fā)現，低磷脅迫條件下，Ospil15突變體和Nip氮含量均比正常磷條件下降低(圖4a、b)。Ospil15突變體在正常磷條件下，地上部中氮含量顯著大于Nip，根中氮含量無顯著差異；低磷脅迫條件下，根中氮含量顯著大于Nip，地上部中氮含量無差異(圖4a、b)。分析Ospil15突變體和Nip在正常磷和低磷脅迫條件下氮吸收效率，發(fā)現Ospil15突變體在正常磷和低磷脅迫條件下的氮吸收效率均高于Nip(圖4c)。另外，分析正常磷和低磷脅迫條件下Ospil15突變體和Nip的氮轉運系數，發(fā)現磷濃度降低后Ospil15突變體和Nip的氮轉運系數均降低。在正常磷條件下，Ospil15突變體氮轉運系數與Nip基本一致；低磷脅迫條件下，Ospil15突變體氮轉運系數小于Nip(圖4d)。綜上，Ospil15突變體提高了水稻氮吸收；在低磷脅迫條件下，Ospil15突變體提高了根中氮含量，但減少了氮從根向地上部的轉運。上述結果表明，OsPIL15基因負調控水稻氮吸收，且正調控氮從根向地上部的轉運。

2.5 OsPIL15基因對水稻磷、氮利用率的影響

本研究不僅分析了Ospil15突變體對氮、磷吸收及轉運的影響，還分析了其對磷、氮利用率的影響。對Ospil15突變體和Nip的磷、氮利用率進行分析，結果發(fā)現，Ospil15突變體在正常磷和低磷脅迫條件下磷、氮利用率均大于Nip(圖5a、b)。這表明OsPIL15基因對水稻氮、磷利用率亦有負調控作用。

3 結論與討論

磷是植物吸收利用的大量元素之一，我國有2/3的耕地缺磷，同時我國存在磷肥施用量大而利用率低的浪費情況。磷礦是不可再生資源，且磷礦資源的消耗加劇[30]。因此，必須改良栽培技術和培育高效吸收利用磷的作物品種。本研究以基因編輯技術獲得的Ospil15突變體為研究材料，發(fā)現Ospil15突變體能提高對磷的吸收利用，這為培育高效吸收利用磷水稻品種和解析水稻磷吸收機制奠定了重要基礎。

本研究發(fā)現，OsPIL15基因對低磷脅迫有響應，推測OsPIL15基因可能調控水稻磷吸收。在低磷脅迫條件下，Nip和Ospil15突變體單株磷含量均較正常磷條件下降低，這與郭再華等[31]的結論一致。Nip和Ospil15突變體在低磷脅迫條件下根長/地上部長和根干質量/地上部干質量均增加，這與劉文菊等[32]研究結果一致。低磷脅迫條件下，Ospil15突變體根長和地上部長降低幅度小于Nip，根干質量降幅小于Nip，地上部干質量降幅與Nip相近，說明其比野生型耐低磷。

Ospil15突變體無論在正常磷還是在低磷脅迫條件下均表現出較高的磷含量和磷吸收效率，這表明OsPIL15基因負調控水稻對磷的吸收。本研究發(fā)現，Ospil15突變體較野生型磷含量增加，說明OsPIL15基因負調控磷素吸收，與SAKURABA等[20]報道的光敏色素互作因子負調控磷吸收一致。

植物對氮、磷吸收存在互作現象[33-35]，低磷脅迫條件下水稻、煙草、大麥、玉米和大豆等作物氮吸收均減少[36-39]。本研究發(fā)現，與野生型相比，Ospil15突變體在正常磷條件下顯著提高了地上部中氮含量，低磷脅迫條件下顯著提高了根中氮含量；氮吸收系數在正常磷與低磷脅迫條件下均大于野生型。這表明OsPIL15基因在磷、氮互作下負調控氮素吸收。OsPIL15基因除調控磷、氮吸收外，對磷、氮的轉運和利用亦有調控。與野生型相比，Ospil15突變體在正常磷條件下降低磷轉運系數，在低磷脅迫條件下提高磷轉運系數、降低氮轉運系數，在正常磷和低磷脅迫條件下均提高了磷、氮利用率。這表明OsPIL15基因在調控水稻磷吸收轉運以及氮、磷互作方面的機制十分復雜。